Identifizierung von T-Zell-erkannten Nierenzellkarzinom-Antigenen

Eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Therapieverfahren ist die Kenntnis immunogener Tumorantigene, die von tumorreaktiven T-Zellen erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T-lymphocytes) aus dem Blut eines HLA (human leukocyte antigen)-kompatiblen Fremdspenders generiert. Methodisch wurden hierzu CD8-selektionierte periphere Blutlymphozyten repetitiv mit der klarzelligen Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC (RCC, renal cell carcinoma) in einer allogenen gemischten Lymphozyten-Tumorzell Kultur (MLTC, mixed lymphocyte tumor cell culture) stimuliert. Aus den Responderlymphozyten wurden mit Hilfe des Grenzverdünnungsverfahrens klonale zytotoxische T-Zellen generiert und expandiert. Die CTL-Klone wurden anschließend phänotypisch mittels Durchflußzytometrie sowie funktionell mittels HLA-Antikörper-Blockadeexperimenten und Kreuzreaktivitätstests detailliert charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß aus dem Blut eines allogenen gesunden Spenders CD8+ T-Zellen isoliert werden können, welche Reaktivität gegen Nierenzellkarzinome (NZK) aufweisen und über verschiedene HLA-Klasse-I-Allele restringiert sind. Die von den einzelnen CTL-Klonen erkannten Zielstrukturen zeigten entweder ubiquitäre (z.B. HLA-Cw*0704-reaktiver CTL-Klon E77) oder eine tumorspezifische (z.B. HLA-B*0702-restringierter CTL-Klon A4) Gewebeexpression. Zur Identifizierung der natürlich prozessierten Peptidliganden wurden die HLA-B/C-Allele unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers B123.2 aus einem zuvor hergestellten Detergenslysat der Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC immunchromatographisch aufgereinigt. Aus den so isolierten HLA-Peptid-Komplexen wurden die tumorassoziierten Peptidliganden nach Säureeluation und Filtration abgespalten und über eine „reverse phase“-HPLC (high performance liquid chromatography) fraktioniert. Die Überprüfung der einzelnen HPLC-Fraktionen auf Bioaktivität erfolgte mit den korrespondierenden CTL-Klonen in 51Cr-Zytotoxizitätstests. Dabei wurde eine HPLC-Fraktion identifiziert, die die lytische Funktion des HLA-B*0702-restringierten CTL-Klons A4 auslösen konnte. Die bioaktive HPLC-Fraktion wurde dazu durch eine zweite (second dimension) Kapillar-Flüssigkeitschromatographie (Cap-LC, capillar liquid chromatography) in Subfraktionen geringerer Komplexität aufgetrennt und die darin enthaltenen Peptidepitope durch das MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight/time of flight)-Analyseverfahren sequenziert. Innerhalb dieser HPLC-Fraktion wurden eine Vielzahl von HLA-B/C-assoziierten Peptidliganden erfolgreich sequenziert, was die Effektivität dieser Verfahrenstechnik zur Identifizierung natürlich prozessierter HLA-Klasse-I-bindender Peptide unter Beweis stellt. Leider war es mit dieser Methode bisher nicht möglich, das von CTL-Klon A4 detektierte Peptidepitop zu sequenzieren. Dies liegt möglicherweise in der unzureichenden Konzentration des Peptidepitops in der bioaktiven HPLC-Fraktion begründet. In Folgearbeiten soll nun mit erhöhter Probenmenge beziehungsweise verbesserter Analytik der erneute Versuch unternommen werden, das Zielantigen des CTL-Klons A4 zu identifizieren. Die Kenntnis von Antigenen, die tumorspezifisch exprimiert und von CD8+ CTL aus gesunden Spendern erkannt werden, eröffnet neue therapeutische Möglichkeiten, das spezifische Immunsystem des Stammzellspenders nach allogener Blutstammzelltransplantation gezielt zur Steigerung von Tumorabstoßungsreaktionen (z.B. durch Vakzinierung oder adoptivem T-Zelltransfer) zu nutzen.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual’s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Methodische Untersuchung zur Diagnostik der bronchialen Hyperreagibilität mit Hilfe eines inhalativen Methacholin-Provokationstests

Die unspezifische Provokation mit Methacholin ist die am weitesten verbreitete und akzeptierte Methode zur Diagnose bzw. zum Ausschluss der bronchialen Hyperreagibilität bei Patienten mit Verdacht auf ein Asthma bronchiale und zu dessen Therapiekontrolle. Um die Sicherheit und die Genauigkeit der Methode weiter zu verbessern, wurde daher ein Dosimeterprotokoll entwickelt, das die inhalierte Methacholin-Dosis anstatt durch die Erhöhung, d.h. in der Regel Verdoppelung, der Methacholinkonzentrationen nur durch Erhöhung der Anzahl der Inhalationen bei konstanter, niedriger Konzentration der Methacholinlösung steigert. Dieses neue Protokoll wurde verglichen mit anderen weit verbreiteten Methacholin-Provokationsprotokollen. Die Methacholinchlorid-Lösung (1,75 mg/ml) wurde mit Hilfe des Dosimetersystems ZAN 200 ProvAir II sowie des Verneblertopfes DeVilbiss 646 vernebelt. 15 Asthmapatienten mit einer vor der Provokation normalen Lungenfunktion (FEV1 98 +/- 9 % PN) und 18 Lungengesunde (FEV1 110 +/- 12 % PN) nahmen an der Testreihe teil. Begonnen wurde mit einer Dosis von 20 μg Methacholinchlorid (= eine Inhalation); beendet wurde der Versuch bei einer Kumulativdosis von 2000 μg Methacholinchlorid, wenn nicht vorher ein Kriterium für einen positiven Test und damit für einen Versuchsabbruch erfüllt wurde. Abbruchkriterien waren entweder ein Abfall der FEV1 um 20 % des Ausgangswertes oder ein Anstieg des totalen Atemwegswiderstandes auf ≥ 0,5 kPa*s/l. Mittels linearer Regression wurden die Provokationsdosen PD 20 FEV1 und PD Rtot ≥ 0,5 berechnet. Im Vergleich mit anderen Protokollen zeigte sich, dass auch das neue Protokoll zuverlässig und sicher zwischen gesund und krank unterscheidet. Der Median der PD 20 FEV1 liegt in der Gruppe der Asthmatiker bei 222 μg, bei den Lungengesunden bei 2000 μg; daraus ergibt sich ein p-Wert von < 0,001. In Bezug auf die PD Rtot ≥ 0,5 liegt der Median bei den Asthmatikern bei 122 μg, in der Gruppe der Lungengesunden bei 2000 μg; hieraus errechnet sich ebenfalls ein p-Wert von < 0,001. Sensitivität und Spezifität der Methode wurden mittels ROC-Kurven untersucht. Basierend auf der PD 20 FEV1 liefert die Methode für die Diagnose einer bronchialen Hyperreagibilität bei einer Enddosis von 1000 μg Methacholinchlorid eine Sensitivität von über 93 % und eine Spezifität von 83 %; basierend auf der PD Rtot ≥ 0,5 liegt die Sensitivität bei einer Dosis von 1000 μg bei 90 %, die Spezifität bei 89 %. Für die gemeinsame Betrachtung der parameterspezifischen Provokationsdosen PD 20 FEV1 und PD Rtot ≥ 0,5, der PD Minimal, bei 1000 μg liegt die Sensitivität bei über 93 % und die Spezifität bei 83 %. Daher können 1000 μg als Schwellendosis für den Ausschluss einer bronchialen Hyperreagibilität zum Untersuchungszeitpunkt angesehen werden, und der Test darf an diesem Punkt abgebrochen werden. Grundsätzlich ist festzustellen, dass die Diagnostik der bronchialen Hyperreagibilität sicher und genau mit Hilfe eines Dosimeterprotokolls erfolgen kann, das die Methacholin-Dosis nur durch die Steigerung der Inhalationen bei gleichbleibender Konzentration der Methacholinlösung erhöht. Die Schwellendosis zwischen normaler und pathologischer bronchialer Reaktion, Sensitivität und Spezifität sowie die Trennschärfe der Methode sind sehr gut vergleichbar mit anderen bisher etablierten Protokollen.

Mass spectrometric identification of Varicella-Zoster Virus (VZV) proteins recognized by human T cells

Primary varicella-zoster virus (VZV) infection during childhood leads to varicella commonly known as chickenpox. After primary infection has occurred VZV establishes latency in the host. During subsequent lifetime the virus can cause reactivated infection clinically known as herpes zoster or shingles. In immunodeficient patients’ dissemination of the virus can lead to life-threatening disease. Withdrawal of acyclovir drug prophylaxis puts allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation (HSCT) patients at increased risk for herpes zoster as long as VZV-specific cellular immunity is impaired. Although an efficient live attenuated VZV vaccine for zoster prophylaxis exists, it is not approved in immunocompromised patients due to safety reasons. Knowledge of immunogenic VZV proteins would allow designing a noninfectious nonhazardous subunit vaccine suitable for patients with immunodeficiencies. The objective of this study was to identify T cell defined virus proteins of a VZV-infected Vero cell extract that we have recently described as a reliable antigen format for interferon-gamma (IFN-γ) enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assays (Distler et al. 2008). We first separated the VZV-infected/-uninfected Vero cell extracts by size filtration and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The collected fractions were screened for VZV reactivity with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of VZV-seropositive healthy individuals in the sensitive IFN-γ ELISpot assay. Using this strategy, we successfully identified bioactive fractions that contained immunogenic VZV material. VZV immune reactivity was mediated by CD4+ memory T lymphocytes (T cells) of VZV-seropositive healthy individuals as demonstrated in experiments with HLA blockade antibodies and T cell subpopulations already published by Distler et al. We next analyzed the bioactive fractions with electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) techniques and identified the sequences of three VZV-derived proteins: glycoprotein E (gE); glycoprotein B (gB), and immediate early protein 62 (IE62). Complementary DNA of these identified proteins was used to generate in vitro transcribed RNA for effective expression in PBMCs by electroporation. We thereby established a reliable and convenient IFN-γ ELISPOT approach to screen PBMCs of healthy donors and HSCT patients for T cell reactivity to single full-length VZV proteins. Application in 10 VZV seropositive healthy donors demonstrated much stronger recognition of glycoproteins gE and gB compared to IE62. In addition, monitoring experiments with ex vivo PBMCs of 3 allo-HSCT patients detected strongly increased CD4+ T cell responses to gE and gB for several weeks to months after zoster onset, while IE62 reactivity remained moderate. Overall our results show for the first time that VZV glycoproteins gE and gB are major targets of the post-transplant anti-zoster CD4+ T cell response. The screening approach introduced herein may help to select VZV proteins recognized by memory CD4+ T cells for inclusion in a subunit vaccine, which can be safely used for zoster prophylaxis in immunocompromised HSCT patients.

Untersuchungen zum Einfluss des malignen Melanoms auf die Frequenz und Funktion regulatorischer T-Zellen

Im Immunsystem spielen regulatorische T-Zellen (Treg) eine essentielle Rolle bei der Unterdrückung und Eindämmung von überschüssigen oder schädlichen Immunreaktionen. Ihre suppressiven Eigenschaften wirken aber auch bei Immune Escape Mechanismen von Tumoren mit und können den Erfolg von Tumorimmuntherapien deutlich mindern.rnIn dieser Arbeit konnte zum ersten Mal die Frequenz verschiedener Treg Subpopulationen im peripheren Blut von gesunden Spendern und Melanompatienten in verschiedenen Stadien der Erkrankung verglichen werden. Dabei wurden Treg-Subpopulationen mit den Markerkombinationen CD4+CD25++, CD4+CD25+CD127low, CD4+CD25+HLA DR+, CD4+Foxp3+, CD4+Foxp3+CD25+, CD4+Foxp3+CD127low und CD4+Foxp3+HLA DR+ untersucht. Insbesondere bei den Subpopulationen, die durch die Expression von Foxp3 charakterisiert sind, konnten in Patienten im Spätstadium IV der Melanomerkrankung, verglichen mit Patienten im Stadium I-II oder gesunden Spendern, erhöhte Treg Frequenzen im peripheren Blut festgestellt werden. Diese Funde korrelierten mit der Beobachtung einer verminderten antigenspezifischen T Zellreaktivität in solchen Melanompatienten. Des Weiteren zeigte sich, dass eine DC basierte Tumorantigen-spezifische Immuntherapie bei einem Teil der behandelten Stadium IV Melanompatienten eine Abnahme der Treg Frequenzen im peripheren Blut zur Folge hatte. Dies korrelierte mit Beobachtungen aus vorangegangenen Studien unserer Arbeitsgruppe, bei denen sich zeigte, dass eine solche Immuntherapie die zuvor supprimierten T Zellantworten zumindest vorübergehend wiederherstellen kann. Bei Untersuchungen zur Expression des IL 1-Rezeptors-1 konnte dieser auf Proteinebene als verstärkt exprimierter Aktivierungsmarker auf Treg bestätigt werden. In Anwesenheit von IL-1 wird die Suppressorfunktion der Treg inhibiert. Eine Konversion von humanen Treg zu nicht suppressorischen TH-17-Zellen durch die Kostimulation mit IL 1 konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Vielmehr scheint die Induktion von IL 2 die entscheidende Wirkung von IL 1 auf humane Treg und Teff darzustellen.rn

Immunevasive Strategien des Humanen Cytomegalovirus : Einfluss des Tegumentproteins pp71 und des Immunevasins gpUS3 auf die MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation infizierter Zellen

Bei Menschen mit unreifem oder geschwächtem Immunsystem kann eine Infektion mit dem Humanen Cytomegalovirus (HCMV) zu schweren Erkrankungen führen. Hingegen kontrolliert das Immunsystem bei Gesunden die HCMV-Infektion fast vollständig. Wichtige Effektoren hierbei sind CD8-positive zytotoxische T-Zellen (CTLs). Um dieser Kontrolle entgegenzuwirken, exprimiert HCMV die als Immunevasine bekannten Proteine gpUS2, gpUS3, gpUS6 und gpUS11. Sie greifen an unterschiedlichen Stellen in die MHC-Klasse-I (MHC-I)-vermittelte Antigenpräsentation ein und schützen so infizierte Zellen vor der Erkennung durch CTLs. Zusätzlich waren auch den Tegumentproteinen pp65 und pp71 immunevasive Funktionen zugeschrieben worden, wobei jedoch über diese Funktionen bisher nur wenig bekannt war. Daher sollte im ersten Teil der vorliegenden Arbeit die Beteiligung von pp71 an der MHC-I-Immunevasion von HCMV-infizierten humanen Fibroblasten untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden HCMV-Mutanten eingesetzt, die pp71 verstärkt exprimierten. Entgegen der postulierten immunevasiven Rolle von pp71 konnte zu keinem Zeitpunkt der Infektion ein inhibierender Effekt von pp71 auf die Antigenpräsentation infizierter Fibroblasten festgestellt werden. Sehr früh nach Infektion war sogar eine pp71-vermittelte Steigerung der Präsentation des HCMV-Proteins IE1 zu beobachten. Um zu prüfen, ob es auch während einer natürlichen Infektion zu einer Erhöhung der pp71-Expression und den damit verbundenen Effekten kommen kann, wurde untersucht, ob die Expression von pp71 durch Zellstress induzierbar ist. Dies erschien möglich, da der Leserahmen für pp71 von einer bizistronischen mRNA kodiert wird. Über die Erzeugung von Zellstress durch Serumentzug konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Expression des wichtigen viralen Transaktivators pp71 abhängig vom physiologischen Zustand der infizierten Zellen reguliert wird. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle des Immunevasins gpUS3 näher beleuchtet werden. Sein Wirkmechanismus war, wie die Mechanismen der drei anderen Immunevasine gpUS2, gpUS6 und gpUS11, bereits ausführlicher untersucht worden. Der individuelle Beitrag von gpUS3 zur MHC-I-Immunevasion in infizierten Zellen sowie ein mögliches Zusammenspiel mit den anderen Immunevasinen waren hingegen noch zu erforschen. Hierzu wurden HCMV-Mutanten eingesetzt, die keines oder nur eines der Immunevasine exprimierten. Mit ihrer Hilfe konnte gezeigt werden, dass gpUS3 sehr früh nach Infektion überraschenderweise die Immunevasion in infizierten Fibroblasten behindert. Zu späteren Infektionszeitpunkten war dagegen ein immunevasiver Effekt von gpUS3 in Form einer Kooperation mit jeweils einem der drei anderen Immunevasine festzustellen. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich die neue Hypothese, dass die Hauptaufgabe von gpUS3 im Rahmen der HCMV-Immunevasion in der Regulation der Funktionen der übrigen Immunevasine liegt.

HLA class II mismatch alleles as targets of the alloreactive CD4 T-cell response

In allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), alloreactive T lymphocytes of donor origin mediate the beneficial graft-versus-leukemia effect but also induce graft-versus-host disease (GvHD). Since human leukocyte antigens (HLA) mismatch alleles represent major targets of alloreactive T lymphocytes, patient and donor are usually matched for the class I molecules A, B, C, and for the class II molecules DRB1 and DQB1, in order do reduce the risk of GvHD. The HLA-DPB1 locus, however, is still ignored in donor selection. Interestingly, clinical studies have demonstrated that disparities at HLA-DQB1 alleles as well as distinct HLA DPB1 mismatch constellations do not adversely affect the outcome of allo-HSCT. It has also been shown that HLA class II is predominantly expressed on hematopoietic cells under non-inflammatory conditions. Therefore, this PhD thesis focused on the application of CD4 T cells in adoptive immunotherapy of leukemias.rnIn the first part of this thesis we developed a rapid screening approach to detect T-cell reactivity of donors to single HLA class II mismatch alleles. Allo-HLA reactivity was measured in naive, memory, and entire CD4 T cells isolated from PBMC of healthy donors by flow cytometric cell sorting according to expression of the differentiation markers CD45RA, CD45RO, CD62L, and CCR7. T-cell populations were defined by a single marker to facilitate translation into a clinical-grade allo-depletion procedure. Alloreactivity to single HLA-DR/-DQ mismatch alleles was analyzed in short-term mixed lymphocyte reactions (MLR) in vitro. As standard antigen-presenting cells, we used the HLA-deficient cell line K562 upon electroporation with single HLA-DR/-DQ allele mRNA. We observed in IFN-γ ELISpot assays that allo-HLA-reactivity preferentially derived from subsets enriched for naive compared to memory T cells in healthy donors, irrespective of the HLA mismatch allele. This separation was most efficient if CD62L (P=0.008) or CD45RA (P=0.011) were used as marker. Median numbers of allo-HLA-reactive effector cells were 3.5-fold and 16.6-fold lower in CD62Lneg and CD45RAneg memory CD4 T cells than in entire CD4 T cells, respectively. In allele-specific analysis, alloreactivity to single HLA-DR alleles clearly exceeded that to HLA-DQ alleles. In terms of alloproliferation no significant difference could be observed between individual CD4 T-cell subsets. rnThe second part of this thesis dealed with the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cells. Naive CD45RApos CD4 T cells isolated from healthy donor PBMC by flow cytometric cell sorting were stimulated in MLR against single allo-HLA-DQ/-DP alleles transfected into autologous mature monocyte-derived dendritic cells by mRNA electroporation. Rapidly expanding HLA-DQ/-DP mismatch reactive T cells significantly recognized and cytolysed primary acute myeloid leukemia (AML) blasts, fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC) in IFN-γ ELISpot and 51chromium release assays if the targets carried the HLA DQ/ DP allele used for T cell priming. While AML blasts were recognized independent of pre-incubating them with IFN-γ, recognition of FB and KC required IFN-γ pre treatment. We further investigated HLA class II expression on hematopoietic and non-hematopoietic cells by flow cytometry. HLA class II was not detected on primary FB, KC, and non-malignant kidney cells, but was expressed at significant levels on primary AML blasts and B-LCL. Up-regulation of HLA class II expression was observed on all cell types after pre-incubation with IFN-γ.rnIn summary, the novel K562-HLA based MLR approach revealed that naive-depleted CD4 T-cell subsets of healthy individuals contain decreased allo-HLA reactivity in vitro. We propose the application of CD45RAneg naive-depleted CD4 T cells as memory T cell therapy, which might be beneficial for HLA-mismatched patients at high-risk of GvHD and low-risk of leukemia relapse. Memory T cells might also provide important post-transplant immune functions against infectious agents. Additionally, the screening approach could be employed as test system to detect donors which have low risks for the emergence of GvHD after allo-HSCT. In the second part of this thesis we developed a protocol for the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cell lines, which could be applied in situations in which patient and donor are matched in all HLA alleles but one HLA-DQ/-DP allele with low GvHD potential. These T cells showed lytic activity to leukemia cells while presumably sparing non-hematopoietic tissues under non-inflammatory conditions. Therefore, they might be advantageous for allo-HSCT patients with advanced stage AML after reduced-intensity conditioning and T-cell depletion for the replenishment of anti-leukemic reactivity if the risk for disease relapse is high. rn

Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources

Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein´s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia´s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients´ anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3-ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3´-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a naïve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer.