Tetracycline-inducible RNAi Knockdown of SCL (Stem Cell Leukaemia) in Mice

RNAi (RNA interference) is a powerful technology for sequence-specific targeting of mRNAs. This thesis was aimed at establishing conditions for conditional RNAi-mediated silencing first in vitro and subsequently also in transgenic mice. As a target the basic helix-loop-helix transcription factor encoding gene SCL (stem cell leukaemia also known as Tal-1 or TCL5) was used. SCL is a key regulator for haematopoietic development and ectopic expression of SCL is correlated with acute T-lymphoblastic leukaemias. Loss of SCL function studies demonstrated that ab initio deletion of SCL resulted in embryonic lethality around day E9 in gestation. To be able to conditionally inactivate SCL, RNAi technology was combined with the tetracycline-dependent regulatory system. This strategy allowed to exogenously control the induction of RNAi in a reversible fashion and consequently the generation of a completely switchable RNAi knockdown. First a suitable vector allowing for co-expression of tetracycline-controlled shRNAs (small hairpin RNAs) and constitutively active EGFP (enhanced green fluorescent protein) was generated. This novel vector, pRNAi-EGFP, was then evaluated for EGFP expression and tetracycline-mediated expression of shRNAs. Four sequences targeting different regions within the SCL mRNA were tested for their efficiency to specifically knockdown SCL. These experiments were performed in M1 murine leukaemia cells and subsequently in the HEK 293 cell line, expressing an engineered HA-tagged SCL protein. The second assay provided a solid experimental method for determining the efficiency of different SCL-siRNA knockdown constructs in tissue culture. Western blotting analyses revealed a down regulation of SCL protein for all four tested SCL-specific target sequences albeit with different knockdown efficiencies (between 25% and 100%). Furthermore, stringent tetracycline-dependent switchability of shRNA expression was confirmed by co-transfecting the SCL-specific pRNAi-EGFP vector (SCL-siRNA) together with the HA-tagged SCL expression plasmid into the HEK 293TR /T-REx cell line constitutively expressing the tetracycline repressor (TetR). These series of experiments demonstrated tight regulation of siRNA expression without background activity. To be able to control the SCL knockdown in vivo and especially to circumvent any possible embryonic lethality a transgenic mouse line with general expression of a tetracycline repressor was needed. Two alternative methods were used to generate TetR mice. The first approach was to co-inject the tetracycline-regulated RNAi vector together with a commercially available and here specifically modified T-REx expression vector (SCL-siRNA T-REx FRT LoxP mouse line). The second method involved the generation of a TetR expressor mouse line, which was then used for donating TetR-positive oocytes for pronuclear injection of the RNAi vector (SCL-siRNA T-REx mouse line). As expected, and in agreement with data from conditional Cre-controlled adult SCL knockout mice, post-transcriptional silencing of SCL by RNAi caused a shift in the maturation of red blood cell populations. This was shown in the bone marrow and peripheral blood by FACS analysis with the red blood cell-specific TER119 and CD71 markers which can be used to define erythrocyte differentiation (Lodish plot technique). In conclusion this study established conditions for effective SCL RNAi-mediated silencing in vitro and in vivo providing an important tool for further investigations into the role of SCL and, more generally, of its in vivo function in haematopoiesis and leukaemia. Most importantly, the here acquired knowledge will now allow the establishment of other completely conditional and reversible knockdown phenotypes in mice.

Development of a field method to assess root parasites of woody plants - ecological analyses of the grapevine-phylloxera interaction

The development and the growth of plants is strongly affected by the interactions between roots, rootrnassociated organisms and rhizosphere communities. Methods to assess such interactions are hardly torndevelop particularly in perennial and woody plants, due to their complex root system structure and theirrntemporal change in physiology patterns. In this respect, grape root systems are not investigated veryrnwell. The aim of the present work was the development of a method to assess and predict interactionsrnat the root system of rootstocks (Vitis berlandieri x Vitis riparia) in field. To achieve this aim, grapernphylloxera (Daktulosphaira vitifoliae Fitch, Hemiptera, Aphidoidea) was used as a graperoot parasitizingrnmodel.rnTo develop the methodical approach, a longt-term trial (2006-2009) was arranged on a commercial usedrnvineyard in Geisenheim/Rheingau. All 2 to 8 weeks the top most 20 cm of soil under the foliage wallrnwere investigated and root material was extracted (n=8-10). To include temporal, spatial and cultivarrnspecific root system dynamics, the extracted root material was analyzed digitally on the morphologicalrnproperties. The grape phylloxera population was quantified and characterized visually on base of theirrnlarvalstages (oviparous, non oviparous and winged preliminary stages). Infection patches (nodosities)rnwere characterized visually as well, partly supported by digital root color analyses. Due to the knownrneffects of fungal endophytes on the vitality of grape phylloxera infested grapevines, fungal endophytesrnwere isolated from nodosity and root tissue and characterized (morphotypes) afterwards. Further abioticrnand biotic soil conditions of the vineyards were assessed. The temporal, spatial and cultivar specificrnsensitivity of single parameters were analyzed by omnibus tests (ANOVAs) and adjacent post-hoc tests.rnThe relations between different parameters were analyzed by multiple regression models.rnQuantitative parameters to assess the degeneration of nodosity, the development nodosity attachedrnroots and to differentiate between nodosities and other root swellings in field were developed. Significantrndifferences were shown between root dynamic including parameters and root dynamic ignoringrnparameters. Regarding the description of grape phylloxera population and root system dynamic, thernmethod showed a high temporal, spatial and cultivar specific sensitivity. Further, specific differencesrncould be shown in the frequency of endophyte morphotypes between root and nodosity tissue as wellrnas between cultivars. Degeneration of nodosities as well as nodosity occupation rates could be relatedrnto the calculated abundances of grape phylloxera population. Further ecological questions consideringrngrape root development (e.g. relation between moisture and root development) and grape phylloxerarnpopulation development (e.g. relation between temperature and population structure) could be answeredrnfor field conditions.rnGenerally, the presented work provides an approach to evaluate vitality of grape root systems. Thisrnapproach can be useful, considering the development of control strategies against soilborne pests inrnviticulture (e.g. grape phylloxera, Sorospheara viticola, Roesleria subterranea (Weinm.) Redhaed) as well as considering the evaluation of integrated management systems in viticulture.

CD137-selektierte leukämiereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leukämiepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leukämie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollständige Leukämieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen könnte die Infusion von leukämiereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leukämie gerichtete Immunantwort und Immunität vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leukämiereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf mögliche GVHD Zielstrukturen zeigen. Für die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufwändig, wobei vor allem eine erhebliche Verkürzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verkürzung der in vitro Kulturzeit könnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder frühen effector memory Phänotyp fördern, für die eine bessere in vivo Effektorfunktion und längere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass dafür das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien könnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leukämiespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifität des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leukämie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und wöchentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation über den Marker CD137 positiv isoliert und anschließend separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zusätzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste während der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalfärbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen könnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen für peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind mögliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein könnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antikörper-beschichteten magnetischen beads untersucht. Für Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren für eine Stimulation während der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zusätzliches CD137-Signal für die länger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung nützlich sein könnte. Die bead-Expansion veränderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine mäßige Verschlechterung der Zytotoxizität im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabhängigen zellschädigenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads führte. Unerwünschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalität durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Veröffentlichungen, die eine fundierte Erklärung für den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten könnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolekül für die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein könnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass für diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.