Oligomerization and protein-protein interactions of the sensory histidine kinase DcuS in Escherichia coli

DcuS is a membrane-integral sensory histidine kinase involved in the DcuSR two-component regulatory system in Escherichia coli by regulating the gene expression of C4-dicarboxylate metabolism in response to external stimuli. How DcuS mediates the signal transduction across the membrane remains little understood. This study focused on the oligomerization and protein-protein interactions of DcuS by using quantitative Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) spectroscopy. A quantitative FRET analysis for fluorescence spectroscopy has been developed in this study, consisting of three steps: (1) flexible background subtraction to yield background-free spectra, (2) a FRET quantification method to determine FRET efficiency (E) and donor fraction (fD = [donor] / ([donor]+[acceptor])) from the spectra, and (3) a model to determine the degree of oligomerization (interaction stoichiometry) in the protein complexes based on E vs. fD. The accuracy and applicability of this analysis was validated by theoretical simulations and experimental systems. These three steps were integrated into a computer procedure as an automatic quantitative FRET analysis which is easy, fast, and allows high-throughout to quantify FRET accurately and robustly, even in living cells. This method was subsequently applied to investigate oligomerization and protein-protein interactions, in particular in living cells. Cyan (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP), two spectral variants of green fluorescent protein, were used as a donor-acceptor pair for in vivo measurements. Based on CFP- and YFP-fusions of non-interacting membrane proteins in the cell membrane, a minor FRET signal (E = 0.06 ± 0.01) can be regarded as an estimate of direct interaction between CFP and YFP moieties of fusion proteins co-localized in the cell membrane (false-positive). To confirm if the FRET occurrence is specific to the interaction of the investigated proteins, their FRET efficiency should be clearly above E = 0.06. The oligomeric state of DcuS was examined both in vivo (CFP/YFP) and in vitro (two different donor-acceptor pairs of organic dyes) by three independent experimental systems. The consistent occurrence of FRET in vitro and in vivo provides the evidence for the homo-dimerization of DcuS as full-length protein for the first time. Moreover, novel interactions (hetero-complexes) between DcuS and its functionally related proteins, citrate-specific sensor kinase CitA and aerobic dicarboxylate transporter DctA respectively, have been identified for the first time by intermolecular FRET in vivo. This analysis can be widely applied as a robust method to determine the interaction stoichiometry of protein complexes for other proteins of interest labeled with adequate fluorophores in vitro or in vivo.

Structure and dynamics of ionic liquid,electrode interfaces

In the early 20th century, Gouy, Chapman, and Stern developed a theory to describe the capacitance and the spatial ion distribution of diluted electrolytes near an electrode. After a century of research, considerable progress has been made in the understanding of the electrolyte/electrode interface. However, its molecular-scale structure and its variation with an applied potential is still under debate. In particular for room-temperature ionic liquids, a new class of solventless electrolytes, the classical theories for the electrical double layer are not applicable. Recently, molecular dynamics simulations and phenomenological theories have attempted to explain the capacitance of the ionic liquid/electrode interface with the molecular-scale structure and dynamics of the ionic liquid near the electrode. rnHowever, experimental evidence is very limited. rnrnIn the presented study, the ion distribution of an ionic liquid near an electrode and its response to applied potentials was examined with sub-molecular resolution. For this purpose, a new sample chamber was constructed, allowing in situ high energy X-ray reflectivity experiments under potential control, as well as impedance spectroscopy measurements. The combination of structural information and electrochmical data provided a comprehensive picture of the electric double layer in ionic liquids. Oscillatory charge density profiles were found, consisting of alternating anion- and cation-enriched layers at both, cathodic and anodic, potentials. This structure was shown to arise from the same ion-ion correlations dominating the liquid bulk structure that were observed as a distinct X-ray diffraction peak. Therefore, existing physically motivated models were refined and verified by comparison with independent measurements. rnrnThe relaxation dynamics of the interfacial structure upon potential variation were studied by time resolved X-ray reflectivity experiments with sub-millisecond resolution. The observed relaxation times during charging/discharging are consistent with the impedance spectroscopy data revealing three processes of vastly different characteristic time-scales. Initially, the ion transport normal to the interface happens on a millisecond-scale. Another 100-millisecond-scale process is associated with molecular reorientation of electrode-adsorbed cations. Further, a minute-scale relaxation was observed, which is tentatively assigned to lateral ordering within the first layer.

Efficient subsequence alignment of time series

Zeitreihen sind allgegenwärtig. Die Erfassung und Verarbeitung kontinuierlich gemessener Daten ist in allen Bereichen der Naturwissenschaften, Medizin und Finanzwelt vertreten. Das enorme Anwachsen aufgezeichneter Datenmengen, sei es durch automatisierte Monitoring-Systeme oder integrierte Sensoren, bedarf außerordentlich schneller Algorithmen in Theorie und Praxis. Infolgedessen beschäftigt sich diese Arbeit mit der effizienten Berechnung von Teilsequenzalignments. Komplexe Algorithmen wie z.B. Anomaliedetektion, Motivfabfrage oder die unüberwachte Extraktion von prototypischen Bausteinen in Zeitreihen machen exzessiven Gebrauch von diesen Alignments. Darin begründet sich der Bedarf nach schnellen Implementierungen. Diese Arbeit untergliedert sich in drei Ansätze, die sich dieser Herausforderung widmen. Das umfasst vier Alignierungsalgorithmen und ihre Parallelisierung auf CUDA-fähiger Hardware, einen Algorithmus zur Segmentierung von Datenströmen und eine einheitliche Behandlung von Liegruppen-wertigen Zeitreihen.rnrnDer erste Beitrag ist eine vollständige CUDA-Portierung der UCR-Suite, die weltführende Implementierung von Teilsequenzalignierung. Das umfasst ein neues Berechnungsschema zur Ermittlung lokaler Alignierungsgüten unter Verwendung z-normierten euklidischen Abstands, welches auf jeder parallelen Hardware mit Unterstützung für schnelle Fouriertransformation einsetzbar ist. Des Weiteren geben wir eine SIMT-verträgliche Umsetzung der Lower-Bound-Kaskade der UCR-Suite zur effizienten Berechnung lokaler Alignierungsgüten unter Dynamic Time Warping an. Beide CUDA-Implementierungen ermöglichen eine um ein bis zwei Größenordnungen schnellere Berechnung als etablierte Methoden.rnrnAls zweites untersuchen wir zwei Linearzeit-Approximierungen für das elastische Alignment von Teilsequenzen. Auf der einen Seite behandeln wir ein SIMT-verträgliches Relaxierungschema für Greedy DTW und seine effiziente CUDA-Parallelisierung. Auf der anderen Seite führen wir ein neues lokales Abstandsmaß ein, den Gliding Elastic Match (GEM), welches mit der gleichen asymptotischen Zeitkomplexität wie Greedy DTW berechnet werden kann, jedoch eine vollständige Relaxierung der Penalty-Matrix bietet. Weitere Verbesserungen umfassen Invarianz gegen Trends auf der Messachse und uniforme Skalierung auf der Zeitachse. Des Weiteren wird eine Erweiterung von GEM zur Multi-Shape-Segmentierung diskutiert und auf Bewegungsdaten evaluiert. Beide CUDA-Parallelisierung verzeichnen Laufzeitverbesserungen um bis zu zwei Größenordnungen.rnrnDie Behandlung von Zeitreihen beschränkt sich in der Literatur in der Regel auf reellwertige Messdaten. Der dritte Beitrag umfasst eine einheitliche Methode zur Behandlung von Liegruppen-wertigen Zeitreihen. Darauf aufbauend werden Distanzmaße auf der Rotationsgruppe SO(3) und auf der euklidischen Gruppe SE(3) behandelt. Des Weiteren werden speichereffiziente Darstellungen und gruppenkompatible Erweiterungen elastischer Maße diskutiert.