Resonante Laserionisations-Massenspektrometrie an Gadolinium zur Isotopenhäufigkeitsanalyse mit geringsten Mengen

Resonante Laserionisations-Massenspektrometrie an Gadolinium zur Isotopenhäufigkeitsanalyse mit geringsten Mengen Die selektive Spuren- und Ultraspurenanalyse des Erdalkalielements Gadolinium eröffnet eine Vielzahl von Anwendungen in der Biomedizin und Kosmochemie. Zum Erreichen der hohen Anforderungen bezüglich Isotopen- und Isobarenselektivität von S>10^7 sowie Gesamteffizienz von e>10^-6 wurde der Einsatz der resonanten Laserionisations-Massenspektrometrie untersucht. Dazu erfolgte die Weiterentwicklung und Anpassung des existierenden Diodenlaser-Quadrupolmassenspektrometersystems. Durch Ionenflugbahn-Simulationsrechnungen wurde für das Quadrupol-Massenspektrometer die erreichbare Nachbarmassenunterdrückung und Transmission in Abhängigkeit von der Auflösung theoretisch vorhergesagt. Die Werte wurden experimentell bestätigt. Aus der beobachteten Peakstruktur erfolgte die Ableitung einer Methode zur Bestimmung der Energieunschärfe des eingesetzten Ionisationsprozesses. Zum Auffinden eines effizienten dreifach resonanten Anregungsschemas wurden die Isotopieverschiebungen und Hyperfeinstrukturen aller stabilen Gadoliniumisotope in zahlreichen Übergängen für die einfach, zweifach und dreifach resonante Ionisation präzise vermessen. Das aufgenommene Spektrum autoionisierender Resonanzen zeigte etwa 150 bislang unbekannter Zustände mit Resonanzüberhöhungen von bis zu fünf Größenordnungen im Ionisationswirkungsquerschnitt. Die entwickelte Methode der Hyperfeinzustandsselektion ermöglichte die Bestimmung der Drehimpulsquantenzahl J der autoionisierenden Resonanzen. Die analytische Charakterisierung der dreistufig resonanten Ionisation von Gadolinium ergab eine Isotopen- und Isobarenselektivität von S(Isotop)>10^12 und S(Isobar)>10^7. Die mit dem Diodenlasersystem erreichte Nachweiseffizienz von e=1-3x10^-6 mit einer untergrundlimitierten Nachweisgrenze von wenigen 10^9 Atomen Gd-158 erlaubte erste Demonstrationsmessungen an medizinischen Gewebeproben.

European phylogeography of the coastal plants Cakile maritima Scop. (Brassicaceae) and Eryngium maritimum L. (Apiaceae)

Linear dispersal systems, such as coastal habitats, are well suited for phylogeographic studies because of their low spatial complexity compared to three dimensional habitats. Widely distributed coastal plant species additionally show azonal and often essentially continuous distributions. These properties, firstly, make it easier to reconstruct historical distributions of coastal plants and, secondly, make it more likely that present distributions contain both Quaternary refugia and recently colonized areas. Taken together this makes it easier to formulate phylogeographic hypotheses. This work investigated the phylogeography of Cakile maritima and Eryngium maritimum, two species growing in sandy habitats along the north Atlantic Ocean and the Mediterranean Sea coasts on two different spatial scales using AFLP data. The genetic structure of these species was investigated by sampling single individuals along most of their distributions from Turkey to south Sweden. On a regional scale the population genetic structure of both species was also studied in detail in the Bosporus and Dardanelles straits, the Strait of Gibraltar and along a continuous stretch of dunes in western France. Additionally, populations of C. maritima were investigated in the Baltic Sea/Kattegat/North Sea area. Over the complete sampling range the species show both differences and similarities in their genetic structure. In the Mediterranean Sea, both species contain Aegean Sea/Black Sea and west Mediterranean clusters. Cakile maritima additionally shows a clustering of Ionian Sea/Adriatic Sea collections. Further, both species show a subdivision of Atlantic Ocean/North Sea/Baltic Sea material from Mediterranean. Within the Atlantic Ocean group, C. maritima from the Baltic Sea and the most northern Atlantic localities form an additional cluster while no such substructure was found in E. maritimum. In all three instances where population genetic investigations of both species were performed in the same area, the results showed almost complete congruency of spatial genetic patterns. In the Aegean/Black Sea/Marmara region a subdivision of populations into a Black Sea, a Sea of Marmara and an Aegean Sea group is shared by both species. In addition the Sea of Marmara populations are more close to the Aegean Sea populations than they are to the Black Sea populations in both cases. Populations from the Atlantic side of the Strait of Gibraltar are differentiated from those on the Mediterranean side in both species, a pattern that confirms the results of the wide scale study. Along the dunes of West France no clear genetic structure could be detected in any of the species. Additionally, the results from the Baltic Sea/North Sea populations of C. maritima did not reveal any geographical genetic pattern. It is postulated that the many congruencies between the species are mainly due to a predominantly sea water mediated seed dispersal in both species and their shared sandy habitat. The results are compared to hypothetical distributions for the last glacial maximum based on species specific temperature requirements. It is argued that in both species the geographical borders of the clusters in the Mediterranean area were not affected by quaternary temperature changes and that the Aegean/Black Sea/Marmara cluster, and possibly the Ionian Sea/Adriatic Sea cluster in C. maritima, is the result of sea currents that isolate these basins from the rest of the sampled areas. The genetic gap in the Strait of Gibraltar between Atlantic Ocean and Mediterranean Sea populations in both species is also explained in terms of sea currents. The existence of three subgroups corresponding to the Aegean Sea, Black Sea and Sea of Marmara basins is suggested to have arisen due to geographical isolation during periods of global sea regressions in the glacials. The population genetic evidence was inconclusive regarding the Baltic Sea cluster of C. Maritima from the wide scale study. The results of this study are very similar to those of an investigation of three other coastal plant species over a similar range. This suggests that the phylo-geographic patterns of widespread coastal plants may be more predictable than those of other terrestrial plants.

Bioinformatische Identifizierung und Charakterisierung von Zyklin-abhängigen Kinasen und Zyklinen des Parasiten Eimeria tenella und deren Nutzung im rationalen Wirkstoffdesign

Parasiten der Apicomplexa umfassen sowohl humanpathogene, als auch tierpathogene Protozoen. Beispiele für wichtige Vertreter human- und tierpathogener Parasiten sind Plasmodium falciparum und Eimeria tenella. E. tenella verursacht die Kokzidiose des Hühnchens, eine Darmerkrankung die weltweit für Verluste in einer geschätzten Höhe von bis zu 3 Milliarden US$ verantwortlich zeichnet. Eine prophylaktische Vakzinierung gegen diese Krankheit ist ökonomisch meist ineffizient, und eine Behandlung mit Kokzidiostatika wird durch häufige Resistenzbildung gegen bekannte Wirkstoffe erschwert. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer kostengünstiger Alternativen. Geeignete Zielproteine für die Entwicklung neuartiger Arzneistoffe zur Behandlung der Kokzidiose sind die Zyklin-abhängigen Kinasen (CDKs), zu denen auch die CDK-related Kinase 2 (EtCRK2) aus E. tenella gehört. Diese Proteine sind maßgeblich an der Regulation des Zellzyklus beteiligt. Durch chemische Validierung mit dem CDK Inhibitor Flavopiridol konnte nachgewiesen werden, dass ein Funktionsverlust von CDKs in E. tenella die Vermehrung des Parasiten in Zellkultur inhibiert. E. tenella CDKs sind daher als Zielproteine für die Entwicklung einer Chemotherapie der Kokzidiose geeignet. Mittels bioinformatischer Tiefenanalysen sollten CDK Proteine im Parasiten E. tenella identifiziert werden. Das Genom von E. tenella liegt in Rohfassung vor [ftp://ftp.sanger.ac.uk]. Jedoch waren zum Zeitpunkt dieser Arbeiten viele Sequenzen des Genoms noch nicht annotiert. Homologe CDK Proteine von E. tenella konnten durch den Vergleich von Sequenzinformationen mit anderen Organismen der Apicomplexa identifiziert und analysiert werden. Durch diese Analysen konnten neben der bereits bekannten EtCRK2, drei weitere, bislang nicht annotierte CDKs in E. tenella identifiziert werden (EtCRK1, EtCRK3 sowie EtMRK). Darüber hinaus wurde eine Analyse der entsprechenden Zykline – der Aktivatoren der CDKs – bezüglich Funktion und Struktur, sowie eine Datenbanksuche nach bisher nicht beschriebenen Zyklinen in E. tenella durchgeführt. Diese Suchen ergaben vier neue potentielle Zykline für E. tenella, wovon EtCYC3a als Aktivator der EtCRK2 von María L. Suárez Fernández (Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim) bestätigt werden konnte. Sequenzvergleiche lassen vermuten, dass auch EtCYC1 und EtCYC3b in der Lage sind, EtCRK2 zu aktivieren. Außerdem ist anzunehmen, dass EtCYC4 als Aktivator der EtCRK1 fungiert. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Suche und Optimierung nach neuen Inhibitoren von CDKs aus E. tenella. In vorangegangenen Arbeiten konnten bereits Inhibitoren der EtCRK2 gefunden werden [BEYER, 2007]. Mittels Substruktur- und Ähnlichkeitssuchen konnten im Rahmen dieser Arbeit weitere Inhibitoren der EtCRK2 identifiziert werden. Vier dieser Strukturklassen erfüllen die Kriterien einer Leitstruktur. Eine dieser Leitstrukturen gehört zur Strukturklasse der Benzimidazol-Carbonitrile und ist bislang nicht als Inhibitor anderer Kinasen beschrieben. Diese neu identifizierte Leitstruktur konnte in silico weiter optimiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Bindungsenergien von Vertretern dieser Strukturklasse berechnet, um einen wahrscheinlichen Bindemodus vorherzusagen. Für die weiterführende in silico Optimierung wurde eine virtuelle kombinatorische Substanzbibliothek dieser Klasse erstellt. Die Auswahl geeigneter Verbindungen für eine chemische Synthese erfolgte durch molekulares Docking unter Nutzung von Homologiemodellen der EtCRK2. Darüber hinaus wurde ein in silico Screening nach potentiellen Inhibitoren der PfMRK und EtMRK durchgeführt. Dabei konnten weitere interessante virtuelle Hit-Strukturen aus einer Substanzdatenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen gefunden werden. Durch dieses virtuelle Screening konnten jeweils sieben Verbindungen als virtuelle Hits der PfMRK sowie der EtMRK identifiziert werden. Die Häufung von Strukturklassen mit bekannter CDK Aktivität deutet darauf hin, dass während des virtuellen Screenings eine Anreicherung von CDK Inhibitoren stattgefunden hat. Diese Ergebnisse lassen auf eine Weiterentwicklung neuer Wirkstoffe gegen Kokzidiose und Malaria hoffen.

Enantioselektive Organokatalyse in Epoxidierungen und Cyanhydrinbildungen

In der vorliegenden Arbeit mit dem Titel „Enantioselektive Organokatalyse in Epoxidierungen und Cyanhydrinbildungen“ wurde die Synthese zweier Cyclophan-carbaldimine durchgeführt. Beide Verbindungen bestehen aus einem Glykosyl-Baustein und einem Paracyclophan-Baustein, die über eine Imin-Bindung verbrückt sind. Die Cyclophan-carbaldimine wurden dann als Katalysatoren in einer Reihe von enantioselektiven Reaktionen verwendet. Enantioselektive Reaktionen bilden von zwei spiegelbildlichen Produkten stets eines im Überschuss. Zu diesen Reaktionen zählen die in dieser Arbeit durchgeführten enantioselektiven Epoxidierungen und enantioselektiven Cyanhydrinsynthesen. Die enantioselektiven Epoxidierungen waren dabei als Teil der Totalsynthesen der Naturstoffe Dasyscyphin D und Caripyrin geplant. Diese beiden Naturstoffe zeigten in biologischen Tests am Institut für Biotechnologie und Wirkstoffforschung (IBWF) in Kaiserslautern Aktivität gegen den Reisbrand-Pilz Magnaporthe grisea, der für Ernteverluste in beträchtlichem Ausmaß verantwortlich ist. Das Caripyrin selbst beinhaltet eine Epoxidstruktur. Mittels der oben angeführten Katalysatoren wurde versucht, diese Epoxidstruktur selektiv einzuführen. Dies gelang nicht, aber der Naturstoff konnte mittels Epoxidierung durch m-Chlorperbenzoesäure erstmals dargestellt werden. In mehreren biologischen Vergleichstests am IBWF Kaiserslautern zeigte auch das synthetische Caripyrin mit dem natürlichen Caripyrin vergleichbare biologische Aktivität.rnDas Dasyscyphin D an sich trägt keine Epoxidfunktion. Dennoch spielt sie auch hier eine wichtige Rolle. Innerhalb der geplanten Totalsynthese von Dasyscyphin D sollte die Farnesylseitenkette eines aromatischen Ringes selektiv epoxidiert werden. Durch einen elektrophilen Angriff an dieses Epoxid sollte im Anschluss eine Cyclisierung zum Dasyscyphin-Grundgerüst eingeleitet werden, aus dem dann Dasyscyphin D dargestellt werden sollte. Im Gegensatz zur Caripyrin-Synthese, bei der die selektive Epoxidierung nicht gelang, scheint sie in der Synthese von Dasyscyphin D sattgefunden zu haben, allerdings ist eine Isolierung des Reaktionsproduktes noch nicht gelungen. Folglich konnte das Dasyscyphin D noch nicht erfolgreich synthetisiert werden.rnDie Versuche zur enantioselektiven Cyanhydrin-Synthese waren nicht Bestandteil einer Totalsynthese. Die Cyanhydrine wurden zuerst als Racemate synthetisiert und gaschromatographisch vermessen, um auf diese Weise die exakten Retentionszeiten der einzelnen Enantiomere zu ermitteln. Anschließend wurden die Cyanhydrine dann enantioselektiv dargestellt und ebenfalls gaschromatographisch vermessen. Durch den Vergleich mit den racemischen Cyanhydrinen konnte dabei direkt aus der Reaktionslösung gemessen werden, was erforderlich war, da eine Isolierung der Cyanhydrine unter den gewählten Reaktionsbedingen nicht gelang. Aus den gaschromatographischen Messungen konnten Enantiomerenüberschüsse von bis zu 95 % ermittelt werden. Weiterhin ergaben die Messungen, dass der Arabinosyl-Katalysator im Vergleich mit dem Galactosyl-Katalysator eine geringere Enantioselektivität induziert, was vermutlich auf leichte räumliche Differenzen der beiden Katalysatoren zurückzuführen ist. Ein weiteres wichtiges Ergebnis war, dass beide Katalysatoren, wie geplant, unterschiedliche Enantiomere im Überschuss bilden. Die Glykosyl- und Paracyclophan-Bausteine der beiden Katalysatoren waren so gewählt worden, dass beide Katalysatoren pseudo-Enantiomere bilden. Auf diese Weise sollte eine Einflussnahme auf das gebildete Enantiomer durch die Wahl des entsprechenden Cyclophan-carbaldimin-Katalysators möglich gemacht werden, was, wie bereits erwähnt, gelang.rn