Untersuchungen zur Rolle des BH3-only-Proteins Bid bei der Stress-induzierten Apoptose in Karzinomzelllinien

Als BH3-only Protein geh��rt Bid zu den proapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie, die w��hrend der Apoptose die Freisetzung Caspase-aktivierender Proteine aus den Mitochondrien kontrollieren. Bid z��hlt zu den potentesten BH3-only Proteinen und wird von vielen transformierten und nichttransformierten Zellen konstitutiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, Bid durch RNA-Interferenz stabil zu depletieren, um Bid-abh��ngige Apoptosewege in HeLa Zervixkarzinomzellen zu identifizieren, die von intrinsischen Stressstimuli sowie von konventionellen und neuartigen Chemotherapeutika induziert werden. Da Bid im Todesrezeptor-vermittelten Signalweg der Apoptose durch Caspase-8 gespalten und aktiviert wird, waren die Bid-depletierten Zellen signifikant vor der Fas/CD95-, TRAIL- oder TNF-��-induzierten Apoptose gesch��tzt und zeigten nach Exposition mit allen drei Todesrezeptorliganden eine drastisch reduzierte Effektorcaspase-Aktivit��t und eine h��here Proliferationsrate als die Kontrollzellen. Eine ektopische Bidexpression in Bid knock down (kd) Zellen hob die Protektion vor der Fas- und TRAIL-induzierten Apoptose auf. Der Proteasominhibitor Epoxomicin, der Proteinkinase-Inhibitor Staurosporin oder die ER Stress-induzierenden Agenzien Tunicamycin, Thapsigargin und Brefeldin A l��sten hingegen einen Bid-unabh��ngigen Zelltod aus. Allerdings konnten subletale Tunicamycin- oder Thapsigarginkonzentrationen HeLa Zellen f��r die TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren. Da der Synergieeffekt auf einer ER Stress-vermittelten Amplifizierung des Todesrezeptorwegs beruhte, zu der eine Tunicamycin-induzierte Steigerung der Expression des Todesrezeptors DR5 signifikant beitrug, erfolgte diese Sensitivierung nur in Bid-profizienten Zellen. Bid war in HeLa Zellen au��erdem an der apoptotischen Signalkaskade beteiligt, die von den DNA-sch��digenden Agenzien Etoposid, Doxorubicin und Oxaliplatin (Oxa) ausgel��st wird. Nach Behandlung mit Oxa zeigten die Bid kd Zellen eine verz��gerte Caspase-2, -3, -8 und -9 Aktivierung, einen geringeren Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie eine reduzierte Apoptose- und eine h��here Proliferationsrate als Bid-profiziente Zellen. Neben Bid war ein weiteres BH3-only Protein, Puma, an der Oxa-induzierten Effektorcaspase-Aktivierung beteiligt, da eine Puma-spezifische siRNA unabh��ngig vom Bidstatus der Zellen antiapoptotisch wirkte. Im letzten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche Proteasen f��r die durch gentoxische Agenzien induzierte Spaltung und Aktivierung von Bid verantwortlich sind. Obwohl Caspasen f��r die Exekutionphase der Oxa-induzierten Apoptose notwendig waren, trugen sie weder zur initialen Bidaktivierung noch zur mitochondrialen Depolarisierung bei, da sie erst postmitochondrial aktiviert wurden. Konventionelle Calpaine hingegen wurden nach DNA-Sch��digung bereits stromaufw��rts der Mitochondrien aktiviert und der Calpaininhibitor Calpeptin reduzierte nicht nur die Bid- und Caspasespaltung, sondern auch die mitochondriale Depolarisierung signifikant. Diese Protektion durch Calpeptin fiel in Bid-depletierten Zellen signifikant geringer als in Bid-profizienten Kontrollzellen aus. Auch war in Oxa-behandelten Bid kd Zellen, die eine durch Caspase-2, -3 und -8 nicht spaltbare Bidmutante exprimierten, trunkiertes Bid nachweisbar, dessen Generierung durch Calpain-, aber nicht durch Caspaseinhibierung verhindert werden konnte. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine Calpain-abh��ngige Bidaktivierung stromaufw��rts der Mitochondrien hin und zeigen, dass die BH3-only Proteine Bid und Puma wichtige Vermittler der Oxa-induzierten Apoptose in HeLa Zellen darstellen.

Rolle der FOS-Proteine und des MAPK-Signallings in der Regulation der zellul��ren Antwort auf genotoxischen Stress

Die mittlere ��berlebenszeit nach Erkennung eines Glioblastoms ohne Behandlung liegt bei 3 Monaten und kann durch die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) auf etwa 15 Monate gesteigert werden. Neben TMZ sind die chlorethylierenden Nitrosoharnstoffe die meistversprechendsten und am h��ufigsten eingesetzten Chemotherapeutika in der Gliomtherapie. Hier liegt die mittlere ��berlebenszeit bei 17,3 Monaten. Um die Therapie des Glioblastoms noch effektiver zu gestalten und Resistenzen zu begegnen, werden unterschiedlichste Ans��tze untersucht. Eine zentrale Rolle spielen hierbei das activator protein 1 (AP-1) und die mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK), deren Funktion in bisherigen Arbeiten noch unzureichend beleuchtet wurde.rnBesonders mit der Rolle des AP-1-bildenden Proteins FRA-1 in der Therapie des Glioblastoms haben sich bisher nur wenige Arbeiten besch��ftigt, weshalb im ersten Teil der vorliegenden Arbeit dessen Funktion in der Regulation der Chemosensitivit��t gegen��ber dem chlorethylierenden Agenz ACNU genauer untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die FRA 1-Expression durch Behandlung mit ACNU induziert wird. Die Induktion erfolgte ��ber die beiden MAPKs ERK1/2 und p38K. JNK hatte keinen Einfluss auf die Induktion. Durch die Herunterregulation der FRA-1-Expression mit Hilfe von siRNA und eines shRNA exprimierenden Plasmids kam es zu einer signifikanten Sensitivierung gegen��ber ACNU. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulation der FRA-1-Expression in einer verminderten AP 1-Bildung, bedingt durch eine reduzierte Menge an FRA-1 im AP-1-Komplex resultiert. Die Sensitivierung gegen��ber ACNU ist weder durch eine Ver��nderung in der DNA-Reparatur, noch in der Modulation der FAS-Ligand- bzw. FAS-Rezeptor-Expression bedingt. Auch die hier untersuchten BCL 2-Familienmitglieder wiesen keine Unterschiede in der Expression durch Modulation der FRA 1-Expression auf. Allerdings kam es durch die verminderte FRA-1-Expression zu einer Reduktion der Zellzahl in der G2/M-Phase nach Behandlung mit ACNU. Diese ging einher mit einer reduzierten Menge an phosphoryliertem und unphosphoryliertem CHK1, weshalb davon auszugehen ist, dass FRA 1 nach ACNU-Behandlung in Gliomzellen vor der Apoptose sch��tzt, indem es modulierend auf die Zellzykluskontrolle einwirkt.rnIm zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation der apoptotischen Antwort nach Behandlung mit ACNU und TMZ genauer beleuchtet, wobei ein spezielles Augen��merk auf AP 1 und die MAPKs gelegt wurde. Hier konnte gezeigt werden, dass die Apoptose nach Behandlung mit ACNU bzw. TMZ sowohl durch Spaltung von Pro-Caspase 8, als auch Pro-Caspase 9 eingeleitet wird. Dabei akkumulierte in beiden F��llen p53 vermehrt im Zellkern. Eine Inhibierung der transkriptionellen Aktivit��t von p53 f��hrte nach ACNU-Behandlung zu einer Sensitivierung der Zellen, nach TMZ-Behandlung kam es zu einem leichten Anstieg in der Vit��lit��t. Der FAS-Rezeptor wurde nach ACNU- und nach TMZ-Behandlung aktiviert und auch die DNA-Reparaturproteine DDB2 und XPC wurden in beiden F��llen vermehrt exprimiert. F��r die MAPKs JNK und ERK1/2 konnte gezeigt werden, dass diese pro-apoptotisch wirken. Die AP-1-Bildung nach ACNU-Behandlung erfolgte bereits nach 24 h und war von langer Dauer, wohingegen nach TMZ-Behandlung nur eine transiente AP 1-Bildung zu relativ sp��ten Zeitpunkten detektiert werden konnte. Ebenso konnte f��r das AP-1-Zielgen FAS-Ligand nach ACNU-Behandlung eine relativ schnelle, lang anhaltende Aktivierung detektiert werden, wohingegen nach TMZ-Behandlung zu einem sp��ten Zeitpunkt ein kurzer Anstieg im Signal zu verzeichnen war. In sp��teren Experimenten konnte gezeigt werden, dass das BCL-2-Familienmitglied BIM eine zentrale Rolle in der Regulation des intrinsischen Apoptosesignalweges nach Behandlung mit ACNU und TMZ spielt. Die hier entstanden Ergebnisse tragen entscheidend zum Verst��ndnis der durch diese beiden Agenzien gesteuerten, apoptotischen Signalwege bei und bieten eine fundierte Grundlage f��r weitere Untersuchungen.rn

Klonierung, Charakterisierung und Funktion der beiden SAPK-Mitglieder JNK und p38 MAPK des marinen Schwamms S. domuncula

Zusammenfassung der Dissertation von Markus B��hm 'Klonierung, Sequenzierung und Funktion der beiden SAPK-Mitglieder JNK und p38 MAPK des marinen Schwamms S. domuncula' am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universit��t Mainz: Da Schw��mme zu den einfachsten Metazoen geh��ren, eignen sie sich gut zur Erforschung von Signaltransduktionsprozessen. Die SAPKs stellen hoch konservierte Signalmolek��le dar, die durch viele Zellstress-ausl��sende Faktoren aktiviert werden und in zahlreichen biologischen Prozessen involviert sind.Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei SAPK-Gene aus S. domuncula isoliert. Ihre abgeleiteten Aminos��uresequenzen wiesen die h��chsten Homologien zu den Mitgliedern der SAPK1/JNK- und SAPK2/p38 MAPK-Subfamilie der Metazoen auf. Die geringste ��bereinstimmung existierte gegen��ber der einzigen SAPK der Hefe (HOG1). Beide Gene des Schwamms besa��en zudem eine au��erordentlich hohe ��bereinstimmung hinsichtlich ihrer Exon/Intron-Strukturen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass die SAPKs der multizellul��ren Tiere durch Duplikation eines HOG1-verwandten Vorl��ufergens entstanden sind. Durch den Vergleich der Intronpositionen mit denen von SAPK-Genen aus D. melanogaster, C. elegans und H. sapiens wurde ersichtlich, dass die Positionen der nichtkodierenden Sequenzbereiche dieser Gene hoch konserviert sind. Western Blot-Analysen demonstrierten, dass beide Schwamm-Kinasen durch hyperosmotischen Stress, LPS und den Phosphataseinhibitor Okadains��ure aktiviert werden. Au��erdem wurde durch Versuche mit HOG1-defizienten Hefemutanten gezeigt, dass sie die Funktion des HOG1-Proteins in S. cerevisiae vollst��ndig ��bernehmen k��nnen. Da die aktivierten Kinasen des Schwamms wie HOG1 im Nukleus der Hefezellen akkumuliert werden, m��ssen die Kerntransportmechanismen der SAPKs ebenfalls evolution��r erhalten sein.

Forstentomologische Untersuchungen an Eichen unterschiedlicher Vitalit��t des Pf��lzerwaldes

Seit Beginn der Waldzustandserhebungen im Jahr 1984 verschlechterte sich der Zustand der Eiche sowohl auf Bundesebene als auch im Land Rheinland-Pfalz deutlich. 1998 konnten nur noch 5 % der rheinland-pf��lzischen Eichen in die Kategorie "ohne Schadensmerkmale" eingestuft werden. Vor diesem Hintergrund ergab sich die Notwendigkeit, die biotischen Stress- und Schadfaktoren n��her zu untersuchen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit lag der Fokus auf den holzbewohnenden K��fern von Traubeneichen (Quercus petraea) aus dem Pf��lzerwald. Zu diesem Zweck wurden f��r die erste Probenserie Untersuchungsb��ume aus den Vitalit��tsstufen 'vital', 'gesch��digt', 'ein Jahr tot' und 'zwei Jahre tot' ausgew��hlt und in die drei Straten Stammfu��, Kronenansatz und Derbholz unterteilt. In der zweiten Probenserie kamen keine 'vitalen' St��mme mehr zum Einsatz. Die einzelnen Proben wurden in Fasseklektoren ��berf��hrt, in denen die xylobionten K��fer ihre Entwicklung beenden und schl��pfen konnten. Die erste Probenserie wurde im Herbst 1998 entnommen, die zweite Serie im darauffolgenden Herbst. Zus��tzlich zu diesen Laboruntersuchungen wurden Freilanduntersuchungen mit Stammeklektoren an vier stehenden Eichen im Wald durchgef��hrt. Die gefangenen Tiere wurden nach Ordnungen sortiert und gez��hlt, die K��fer nach M��glichkeit bis zur Art bestimmt. Die Ergebnisse der ersten und zweiten Serie wurden in Abundanzen (Ind./m�� Rindenoberfl��che) umgerechnet, um einen Vergleich der Proben untereinander m��glich zu machen. Insgesamt wurden aus den Fasseklektoren beider Serien K��fer mit einer Abundanz von 36.990 Ind./m�� ausgewertet. In den Fallen der Stammeklektoren wurden insgesamt 1.487 K��fer gefunden. Den weitaus gr����ten Teil der K��fer der Fasseklektoren stellen die Borkenk��fer (Scolytidae). Dieses Ergebnis schl��gt sich auch in der Betrachtung der Dominanz der einzelnen Arten nieder. In nahezu allen F��llen geh��rten die Hauptarten in die Familie Scolytidae. Der mit den Absterbeerscheinungen der Eichen in Verbindung gebrachte Prachtk��fer Agrilus biguttatus (Buprestidae) trat in deutlich geringeren Abundanzen auf. Aufgrund seiner Fra��t��tigkeit (Ringelung der Larven im Kambialbereich der B��ume) geh��rt er aber zu den potentiell stark sch��digenden K��fern. Neben A. biguttatus sind auch A. sulcicollis und die gefundenen Borkenk��fer in der Lage, vorgesch��digte und geschw��chte Eichen zu befallen und noch weiter zu schw��chen. Aus waldhygienischen Gr��nden sollten deshalb regelm����ige Kontrollen durchgef��hrt werden. Bei erkennbarem Befall sollten die betroffenen B��ume gef��llt und aus dem Bestand entfernt werden. Langfristig k��nnen die Vermeidung von nicht-standortgerechtem Eichenanbau und das Anlegen von naturnahen Mischbest��nden zu den waldbaulichen Ma��nahmen gerechnet werden, die eine Reduktion des Infektionsrisikos zur Folge haben. Die 'ein Jahr toten' B��ume wiesen die mit Abstand h��chste Abundanz an Lebendholzbesiedlern auf. B��ume, die bereits ein Jahr l��nger tot im Bestand standen, wurden von deutlich weniger Lebendholzbesiedlern befallen, d.h. von 'zwei Jahre toten' B��umen ging ein potentiell geringerer Infektionsdruck aus als von 'ein Jahr toten' Eichen. Im Laufe des Verrottungsprozesses verringert sich diese Gefahr noch weiter, da die Holzfeuchte weiter abnimmt und die Lebendholzbesiedler keine Nahrungsgrundlage mehr vorfinden. Besonders die Gefahr des Neubefalls durch Agrilus von mindestens zweij��hrig toten B��umen besteht kaum, weil zumindest die Larven der ersten Stadien des Prachtk��fers auf lebendes Gewebe angewiesen sind.

Genetische Analyse des Somatostatin-Systems

Somatostatin ist ein Molek��l mit multifunktinonellem Charakter, dem Neurotransmitter-, Neuromodulator- und (Neuro)-Hormoneigenschaften zugeschrieben werden. Gem���� seiner ubiquit��ren Verteilung in Geweben beeinflusst es Stoffwechsel- und Entwicklungsprozesse, bis hin zu Lern-und Ged��chtnisleistungen. Diese Wirkungen resultieren aus dem lokalen und zeitlichen Zusammenspiel eines Liganden und f��nf G-Protein gekoppelter Rezeptoren (SSTR1-5). Zur Charakterisierung der biologischen Bedeutung des Somatostatin-Systems im Gesamtorganismus wurde eine Mutationsanalyse einzelner Systemkomponenten durchgef��hrt. Sie umfa��te die Inaktivierung der Gene f��r das Somatostatin-Pr��propeptid und die der Rezeptoren SSTR3 und SSTR4 durch Gene Targeting. Die entsprechenden Ausfallmutationen belegen: Weder die Rezeptoren 3 und 4, noch Somatostatin sind f��r das ��berleben des Organismus unter Standardhaltungsbedingungen notwendig. Die entsprechenden Mauslinien zeigen keine unmittelbar auff��lligen Einschr��nkungen ihrer Biologie. Die Somatostatin-Nullmaus wurde zum Hauptgegenstand einer detaillierten Untersuchung aufgrund der ��bergeordneten Position des Liganden in der Signalkaskade und verf��gbaren Hinweisen zu seiner Funktion. Folgende Schlu��folgerungen konnten nach eingehender Analyse gezogen werden: Der Ausfall des Somatostatin-Gens hat erh��hte Plasmakonzentrationen an Wachstumshormon (GH) zur Konsequenz. Dies steht im Einklang mit der Rolle Somatostatins als hemmender Faktor der Wachstumshormon-Freisetzung, die in der Mutante aufgehoben ist. Durch die Somatostatin-Nullmaus wurde zudem deutlich: Somatostatin interagiert als wesentliches Bindeglied zwischen der Wachstums- und Stre��achse. Permanent erh��hte Corticosteron-Werte in den Mutanten implizieren einen negativen tonischen Einflu�� f��r die Sekretion von Glukocorticoiden in vivo. Damit zeigt die Knockout-Maus, da�� Somatostatin normalerweise als ein entscheidendes inhibierendes Kontrollelement der Steroidfreisetzung fungiert. Verhaltensversuche offenbarten ein Defizit im motorischen Lernen. Somatostatin-Nullm��use bleiben im Lernparadigma ���Rotierender Stabtest��� hinter ihren Artgenossen zur��ck ohne aber generell in Motorik oder Koordination eingeschr��nkt zu sein. Diese motorischen Lernvorg��nge sind von einem funktionierenden Kleinhirn abh��ngig. Da Somatostatin und seine Rezeptoren kaum im adulten, wohl aber im sich entwickelnden Kleinhirn auftreten, belegt dieses Ergebnis die Funktion transient in der Entwicklung exprimierter Neuropeptide ��� eine lang bestehende, aber bislang experimentell nicht nachgewiesene Hypothese. Die ��berpr��fung weiterer physiologischer Parameter und Verhaltenskategorien unter Standard-Laborbedingunggen ergab keine sichtbaren Abweichungen im Vergleich zu Wildtyp-M��usen. Damit steht nun ein Tiermodell zur weiterf��hrenden Analyse f��r die Somatostatin-Forschung bereit: In endokrinologischen, elektrophysiologischen und verhaltens-biologischen Experimenten ist nun eine unmittelbare Korrelation selektiv mit dem Somatostatin-Peptid bzw. mit den Rezeptoren 3 und 4 aber auch in Kombination der Ausfallmutationen nach entsprechenden Kreuzungen m��glich.

Entstehung und Dynamik des Keratinfilament-Netzwerks

Das zytoplasmatische Zytoskelett besteht aus drei Filamentsystemen, die aus Aktin, Tubulin und Intermedi��rfilamentproteinen aufgebaut sind und dreidimensionale Netzwerke ausbilden. Das Intermedi��rfilamentsystem, dem vor allem mechanische Stabilisierungsfunktionen zugesprochen werden, unterscheidet sich von den anderen durch seine F��higkeit, spontan aus seinen Polypeptiduntereinheiten ohne weitere Kofaktoren zu polymerisieren und durch seinen unpolaren Aufbau. Es ist bis heute unbekannt, wie Intermedi��rfilamentnetzwerke in vivo moduliert werden und wie ihre Anordnung in den Kontext des Gesamtzytoskeletts koordiniert wird. Am Beispiel der epithelialen Intermedi��rfilamentproteine, den Keratinen, sollte daher untersucht werden, wie und wo neue Intermedi��rfilamente entstehen, welche Bedeutung den anderen Filamentsystemen bei dem Netzwerkaufbau und ���Turn-Over zukommen und wie die Netzwerkbildung gesteuert wird. Zur Beantwortung dieser Fragestellungen wurden Zellklone hergestellt, die fluoreszierende Keratine synthetisieren. In der Zelllinie SK8/18-2, deren gesamtes Netzwerk aus derartigen Chim��ren aufgebaut ist, konnten anhand von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen der Fluoreszenzmuster Keratinfilamentvorl��ufer (KFP) identifiziert und deren Dynamik direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die KFP in einem Plasmamembran-nahen Bereich entstehen, in dem sie zuerst als punktf��rmige Partikel detektiert werden. Nach einer initialen, sph��roidalen Wachstumsphase elongieren die Partikel zu kleinen Filamentst��ckchen. Diese k��nnen miteinander fusionieren und werden ��ber ihre Enden in das periphere Netzwerk integriert. Der Wachstumsprozess ist gekoppelt an eine kontinuierliche, langsame Bewegung in Richtung auf das Zellzentrum. Diese Motilit��t sistiert vollst��ndig nach pharmakologisch induziertem Abbau der Aktinfilamente. In Zeitraffer-aufnahmen kann jedoch in derartig behandelten Zellen ein wesentlich schnellerer Transport, der in verschiedene Richtungen verl��uft und durch lange Ruhephasen unterbrochen wird, beobachtet werden. Dieser Modus, der gelegentlich auch in unbehandelten Zellen gefunden wurde, ist abh��ngig von intakten Mikrotubuli. Erst durch Zerst��rung der Aktinfilamente und der Mikrotubuli erlischt die Motilit��t der KFPs vollst��ndig. Bei der Suche nach Regulatoren der Keratinnetzwerkbildung wurde die p38 MAPK als zentraler Faktor identifiziert. Erstmals konnte eine direkte r��umliche und zeitliche Korrelation zwischen einer spezifischen Enzymaktivit��t durch Nachweis der phosphorylierten p38 MAPK, der daraus folgenden Phosphorylierung eines Keratins, hier Serin 73 des Keratin 8, und der daraus resultierenden Ver��nderung des Netzwerkaufbaus, d. h. der Ausbildung von Keratingranula, nachgewiesen werden. Diese koordinierten Ver��nderungen wurden in unterschiedlichen Stresssituationen in verschiedenen Zellsystemen und in Zellen mit mutierten Keratinen beobachtet. Genetische (shRNA) und pharmakologische Manipulationen der p38 MAPK-Aktivit��t deuten auf einen engen kausalen Zusammenhang hin.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorl��ufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorl��ufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verh��ltnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die ��ber den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist f��r das ��berleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. St��rungen der Calcium-Hom��ostase sind ein bekanntes Ph��nomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von ��berexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgel��st. Dies f��hrt zur Induktion der sogenannten ���unfolded protein response��� (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. F��r APP-��berexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erh��hte intrazellul��re Calcium Konzentration nachgewiesen werden. ��ber die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-��berexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellul��ren Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle g��nzlich unterdr��ckt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kan��len (SOCC) eine signifikante Unterdr��ckung der beobachteten erh��hten intrazellul��ren Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-��berexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verl��uft in einer UPR-unabh��ngigen Reaktion ��ber die Aktivierung von SOCC���s, einer erh��hten Aufnahme von extrazellul��rem Calcium und durch erh��hte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPP��-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodom��ne von APP, die ��ber die Aktivit��t der ��-Sekretase prozessiert wird und anschlie��end extrazellul��r abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen f��r Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPP�� in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Sch��den, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu sch��tzen. Au��erdem konnte gezeigt werden, dass sAPP�� in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPP��-vermittelten Protektion konnte ��ber die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPP��-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPP��-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch h��herer Effizienz APP-��berexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu sch��tzen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-��berexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erh��hung der sAPP�� Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fetts��uren wirken sich positiv auf die Membranfluidit��t von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen A�� Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin sch��tzte die Omega-3 Fetts��ure Docosahexaens��ure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-��berexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz f��r die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein k��nnte.

Regulation der Stress-aktivierten Proteinkinasen durch den gentoxischen Benzo[a]pyren-Metaboliten BPDE

Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind ubiquit��re Verschmutzungen der Umwelt und entstehen w��hrend der unvollst��ndigen Verbrennung organischen Materials wie Holz, Kohle und Erd��l. Werden diese chemisch nicht reaktiven PAK in den K��rper aufgenommen, durchlaufen sie eine Reihe von enzymatischen Umsetzungen, die unter der Bezeichnung Fremdstoffmetabolismus zusammengefasst werden. Die chemische Umsetzung des PAK und Prokarzinogens Benzo[a]pyren (B[a]P) f��hrt u.a. zur Bildung des reaktiven Metaboliten B[a]P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE). BPDE ist stark elektrophil und kann auf Grund dieser Eigenschaft an nukleophile Makromolek��le wie Proteine und DNA binden. Die Bildung von BPDE-DNA-Addukten resultiert in der Entstehung von Mutationen und kann zur Tumorbildung f��hren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Wirkung von BPDE als Modellsubstanz f��r gentoxische Agenzien auf intrazellul��re Signalkaskaden und die Konsequenzen der BPDE-Exposition bez��glich der Zellaktivit��t untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass BPDE-Behandlung von Mausfibroblasten eine intrazellul��re Signalkaskade induziert, welche zur Aktivierung der Stressaktivierten Proteinkinasen (SAPK) JNK und p38 f��hrt. An dieser Signalkaskade sind Src-��hnliche Kinasen beteiligt. BPDE-Behandlung f��hrt in den untersuchten Mausfibroblasten zur Induktion von DNA-Einzelstrangbr��chen, deren Auftreten zeitlich mit der SAPK-Aktivierung korreliert. Die BPDEinduzierten DNA-Strangbr��che sind die Folge der Entfernung dieser L��sionen aus dem Genom durch die Nukleotidexzisionsreparatur (NER). Erkannt werden BPDE-DNA-Addukte durch die NERProteine XPA und XPC (Xeroderma Pigmentosum Komplementationsgruppe A und C). Nach der Erkennung von BPDE-DNA-Addukten kommt es zur Rekrutierung von Nukleasen, welche die vorliegende L��sion und umliegende Nukleotide aus dem Genom entfernen. In XPA- und XPCdefizienten Mausfibroblasten induziert BPDE daher keine DNA-Strangbr��che. Jedoch ist nur in XPCdefizienten Zellen, aber nicht in XPA-defizienten Zellen, die SAPK-Aktivierung drastisch reduziert. Behandlung von Mausfibroblasten mit Benzo[c]phenanthren-3,4-Diol-1,2-Epoxid, einem PAK, dessen DNA-Addukte schlecht durch NER-Faktoren erkannt und repariert werden, f��hrt zu keiner SAPKAktivierung. Die Aktivierung von p38 und JNK scheint demnach abh��ngig zu sein von der Erkennung des prim��ren DNA-Schadens. Die XPC-abh��ngige SAPK-Aktivierung sch��tzt die Zellen vor BPDEabh��ngiger Toxizit��t, da sowohl XPC- als auch p38-defiziente Mausfibroblasten eine h��here Sensitivit��t gegen��ber BPDE zeigen als korrespondierende Wildtypzellen. Zusamenfassend konnte in dieser Arbeit ein neuer Signalweg beschrieben werden, in dem DNASch��den, verursacht durch BPDE, ��ber die XPC-abh��ngige DNA-Schadenserkennung, die Aktivierung der SAPK induziert. Diese Aktivierung der SAPK sch��tzt vor BPDE-induzierter Toxizit��t.

Einfluss von oxidativem Stress auf die DNA-Reparatur in S��ugerzellen

Gegenstand dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel zwischen DNA-Reparatur und zellul��rem anitoxidativen Abwehrsystem in Melanomzellen und gesunden Hautfibroblasten n��her zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die dominierenden DNA-L��sionen im Falle einer Bestrahlung mit sichtbarem Licht (400 ��� 800 nm) Fpg-sensitive L��sionen, zu denen die Basenmodifikation 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG) geh��rt, und im Falle der UVA-Bestrahlung Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPDs) sind. Sowohl Melanomzellen als auch Hautfibroblasten waren problemlos in der Lage, die durch sichtbares Licht und UVA-Strahlung induzierten oxidativen DNA-Modifikationen zu reparieren. Jedoch reagierten Melanomzellen in einer adaptiven Antwort mit einer Erh��hung ihres Glutathion-Gehalts auf ein Maximum (nach circa 10 - 14 h) nach Bestrahlung mit sichtbarem Licht, wohingegen die Hautfibroblasten einen massiven Einbruch direkt nach Bestrahlung und eine extrem lange Erholungsphase ��ber 48 h aufzuweisen hatten. Die darauffolgende Untersuchung der DNA-Reparaturkapazit��t der Zellen unter Bedingungen von oxidativem Stress mit vorangegangener Depletion intrazellul��ren Glutathions zeigten eine dramatische, nahezu vollst��ndige Hemmung der Reparatur durch UVA- bzw. Sonnenlicht-induzierter Fpg-sensitiver DNA-Modifikationen (8-oxoG) - sowohl in Melanomzellen als auch in Hautfibroblasten. Dieser Effekt lie�� sich durch den Zusatz von Dithiothreitol (DTT), nach erfolgter Bestrahlung der Glutathion-depletierten Zellen, wieder komplett revertieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass an der Reparatur ein redoxempfindliches Protein oder zellul��rer Cofaktor beteiligt sein mu��. Zudem konnte durch Untersuchungen der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und der Einzelstrangbruchreparatur nach dem gleichen Versuchsdesign gezeigt werden, dass es sich hierbei sehr wahrscheinlich um einen f��r die Basenexzisionsreparatur (BER) von 7,8-dihydro-8-oxo-guanine (8-oxoG) exklusiven Effekt handelte. Zwei der wichtigsten Reparaturproteine der BER, n��mlich hOGG1 und APE1, wurden anschlie��end auf ihre Funktionsf��higkeit hin untersucht, da es naheliegend war, dass der Reparaturhemmung ein Funktionsverlust eines dieser beiden Enzyme zugrunde liegen k��nnte. Im Falle des APE1-Proteins konnte dies ausgeschlossen werden, da mit Hilfe der Alkalischen Elution die volle Funktionsf��higkeit f��r die Reparatur von AP-L��sionen nachgewiesen werden konnte. Interessanterweise zeigte aber das hOGG1-Protein eine zwischen der dritten und vierten Stunde nach Bestrahlung Glutathion-depletierter Zellen stark abfallende Aktivit��t der 8-oxoG-Glykosylasefunktion. Die Western-Blot-Analyse ergab allerdings keinen Hinweis auf eine Proteinoxidation von hOGG1. M��glicherweise wird nicht hOGG1 selbst, wohl aber ein anderes, f��r eine konzertierte Abfolge der einzelnen Reparaturschritte entscheidend notwendiges Protein innerhalb der Zelle durch ROS leicht oxidiert. In jedem Fall bleibt festzustellen, dass Glutathion eine wichtige Aufgabe hinsichtlich einer voll funktionsf��higen Basenexzisionreparatur zuzukommen scheint. Die Ergebnisse unterstreichen die m��gliche Bedeutung von oxidativem Stress f��r die Entstehung von Krebs durch Sonnenlicht, insbesondere durch UVA, da die durch die Strahlung (und eventuell auftretende Entz��ndung) gebildeten ROS nicht nur DNA-Sch��den induzieren, sondern auch ihre Reparatur verhindern k��nnen.

Charakterisierung der neuroprotektiven Eigenschaften des Corticotropin-Releasing-Hormons

Das Corticotropin Releasing Hormon (CRH) ist ein zentraler Mediator des neuroendokrinen Systems von S��ugetieren und kontrolliert die physiologische Stressreaktion des K��rpers. Zudem zeigten in vitro Daten, dass es Neuroprotektion gegen��ber oxidativem Stress induzieren kann. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein neuroprotektiver Effekt des CRH in vivo gezeigt werden. Die ��berexpression des CRH im ZNS von M��usen konnte Nervenzellen in vivo vor Exzitotoxizit��t sch��tzen; nach Injektion des Exzitotoxins Kainat verk��rzte die CRH-��berexpression die Dauer der epileptischen Anf��lle, sch��tzte die Neurone der betroffenen Hippocampusregion vor Zelltod und verhinderte die bei Exzitotoxizit��t und vielen neurodegenerativen Erkrankungen auftretende Neuroinflammation. Desweiteren konnten in CRH-��berexprimierenden Tieren erh��hte BDNF-Proteinspiegel nachgewiesen werden. BDNF, ein bedeutender neurotropher Faktor im ZNS, vermittelt daher teilweise die CRH-induzierte Neuroprotektion gegen��ber der Exzitotoxizit��t in vivo. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Connexin43, dem Haupt-Gap Junction-Protein der Astrozyten, ein neues CRH-Zielgen im ZNS identifiziert. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass CRH sowohl die Expression des Connexin43-Gens als auch den Connexin43-Proteinspiegel in vitro und in vivo erh��ht. Diese Effekte werden ��ber die Aktivierung des CRH-Rezeptor 1 und nachfolgend der PKA- und MAPK-Signalwege vermittelt. In ��bereinstimmung mit der Hochregulation des Connexin43-Proteinspiegels verst��rkte CRH auch die interzellul��re Kommunikation ��ber Gap Junctions. Physiologisch hat diese CRH-induzierte Verst��rkung der astrozyt��ren Gap Junction-Kommunikation eine gro��e Bedeutung f��r die Neuroprotektion, da eine Hochregulation der interzellul��ren Kommunikation schnell toxische Molek��le verd��nnt, Energiesubstrate und protektive Faktoren verteilt und Ionen abpuffert. Dadurch werden Sch��digungen durch oxidativen Stress in den Zellen reduziert, was ��ber die Analyse der Proteincarbonylierung gezeigt wurde. Die Relevanz der astrozyt��ren Gap Junction-Kommunikation f��r das ��berleben der Neurone konnte in organotypischen hippocampalen Schnitten und in Neuron-Astrozyten-Co-Kulturen deutlich gemacht werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten zeigen, dass die Stress-induzierte Sekretion von CRH im ZNS zur verst��rkten Expression neuroprotektiver Molek��le wie BDNF und Connexin43 beitr��gt. Diese verm��gen Neurone gegen��ber toxischen Einfl��ssen zu sch��tzen und zum Erhalt ihrer Funktion beizutragen. Die protektiven CRH-Effekte k��nnten speziell bei chronischen neurodegenerativen Krankheiten wie der Alzheimerschen Demenz und der Parkinsonschen Krankheit hilfreich sein.

Bedeutung von Rho-GTPasen bei der Regulation zellul��rer Antworten auf genotoxischen Stress

SAPK/JNK regulieren nach genotoxischem Stress eine Vielzahl von Zielsubstraten, die bedeutsam f��r Reparatur und ��berleben der Zelle sind, somit nehmen sie Einfluss auf das zellul��re Schicksal der Zelle. Ob DNA-Sch��den eine Phosphorylierung von Stress-Kinasen nach sich ziehen ist bisher noch wenig untersucht. Mit reparaturdefizienten Zellen wurde der Einfluss von DNA-Sch��den, durch Cisplatin/Transplatin/UV-C, auf die SAPK/JNK Aktivierung untersucht. Die Aktivierung der Stress-Kinasen erfolgte agenzspezifisch und abh��ngig von verschieden Reparaturfaktoren. Die Aktivierung korrelierte in reparaturdefizienten Zellen teilweise mit dem sp��ten Auftreten von DNA-Strangbr��chen, war jedoch unabh��ngig von erh��hten initialen DNA-Sch��den. Diese Befunde zeigten, dass die sp��te Aktivierung der SAPK/JNK DNA-schadensabh��ngig verl��uft und das Cisplatin und Transplatin bei Verwendung von ��quitoxischen Dosen zu einer vergleichbaren Aktivierung von SAPK/JNK f��hrten. Die Hemmung der Rho-GTPasen sowohl durch Statine als auch mittels Clostridium difficile Toxin B zeigte weiterhin, dass Rho-GTPasen m��glicherweise die sp��te DNA-schadensabh��ngige Aktivierung der Stress-Kinasen vermitteln. Die Hemmung von Rho-GTPasen durch physiologisch relevante Konzentrationen von Statinen f��hrte in prim��ren humanen Endothelzellen (HUVECs) zu einer Protektion vor IR-Strahlung und Doxorubicin. In beiden F��llen konnte eine Hemmung des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors p53 sowie der Chk1, welche einen Zellzyklusarrest reguliert, mit der Statin-Behandlung erreicht werden. Effektor-Caspasen wurden dabei durch den HMG-CoA-Reduktase Hemmer nicht beeinflusst. Ausschlie��lich bei dem Statin-vermittelten Schutz vor Doxorubicin kam es zu einer Reduktion von initialen DNA-Sch��den, in Form von DNA-Strangbr��chen. Die IR-induzierten Strangbr��che in der DNA blieben von der Statin-Inkubation hingegen unbeeinflusst. Aufgrund ihrer protektiven Eigenschaften gegen��ber IR- und Doxorubicin-induzierter Zytotoxizit��t in Endothelzellen und ihrer pro-apoptotischen Wirkung auf Tumorzellen k��nnten Statine m��glicherweise die unerw��nschten Nebenwirkungen von Zytostatika und einer Strahlentherapie g��nstig beeinflussen

Untersuchungen des Keratinfilament-Turnovers in lebenden Zellen

Das Zytoskelett eukaryotischer Zellen besteht aus drei verschiedenen Protein-Netzwerken: den Aktinfilamenten, Mikrotubuli und Intermedi��rfilamenten. Intermedi��rfilamente wurden urspr��nglich als statische Strukturen angesehen, die die mechanische Stabilisierung der Zellen ��bernehmen. In den letzten Jahren hat sich dieses Bild jedoch ge��ndert: Intermedi��rfilament-Netzwerke sind hochdynamisch und unterliegen kontinuierlichen Ver��nderungen, welche durch Phosphorylierungen reguliert werden. Sie interagieren mit anderen Zytoskelett-Proteinen und greifen in die Regulation von Schl��sselsignalwegen, die Zellwachstum und Zellteilung sowie Apoptose und Stressantwort bestimmen, ein. Die Mechanismen der Filamentplastizit��t konnten bisher jedoch nicht vollst��ndig aufgekl��rt werden. So ist beispielsweise unklar, wo Auf- und Abbau der Filamente stattfindet und welche Faktoren an der Netzwerkmodulation beteiligt sind. Ziel meiner Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufkl��rung dieser Mechanismen am Beispiel der epithelialen Keratin-Intermedi��rfilamente zu leisten. Mit Hilfe von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen von fluoreszenzmarkierten Zellklonen wurden Nukleationszentren in der Zellperipherie identifiziert, in denen Keratinfilamentvorl��ufer gebildet werden. Es handelt sich dabei um fokale Adh��sionskomplexe, die als Anheftungsstellen zwischen der extrazellul��ren Matrix und dem intrazellul��ren Aktinfilament-System dienen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Filamentvorl��ufer-Entstehung f��r alle untersuchten Keratinisoformen g��ltig ist und in epitelialen als auch nicht-epithelialen Zelltypen abl��uft. Knock-Down der Adh��sionskomponente Talin verhinderte die Keratinfilamentbildung. Modulation der fokalen Adh��sionskinase, die den Auf- und Abbau der Adh��sionskomplexe koordiniert, beeinflusste ebenso die Bildung der Keratinfilamentnetzwerke. Es konnte weiterhin beobachtet werden, dass die N-terminalen Isoformen IE und IF des Zytolinkers Plectin in fokalen Adh��sionen lokalisieren und damit m��glicherweise an der Vernetzung von Keratinfilamentvorl��ufern, Zelladh��sionen und Aktinfilamenten beteiligt sind. Letztlich stellte sich heraus, dass die Bildung der Keratinfilamentvorl��ufer unabh��ngig von Proteintranslation ist. In den mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen wurde im Anschluss an die Keratinfilamentbildung ein kontinuierlicher zentripetaler Transport der wachsenden Vorl��uferpartikel beobachtet. An Hand von pharmakologischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass dieser Transport Aktinfilament-abh��ngig ist. Zeitgleich kommt es zu Partikelfusion und Integration in das periphere Netzwerk, das sich weiterhin in Richtung auf das Zellzentrum bewegt. Mit Hilfe von Photoaktivierungsversuchen und Zellfusionsexperimenten konnte die Hypothese best��tigt werden, dass der Abbau der einwandernden Keratinfilamente in l��sliche, rasch diffusible Zwischenstufen den kontinuierlichen peripheren Neuaufbau erm��glicht. Aus den Beobachtungen und bereits bekannten Ergebnissen wurde ein Modell des Keratin-Zyklus entwickelt, das die folgenden Stadien umfasst: Nukleation von Keratinfilamentvorl��ufern an fokalen Adh��sionen in der Zellperipherie, Elongation und Fusion der Keratinfilamentvorl��ufer bei zeitgleichem Aktinfilament-abh��ngigem zentripetalen Transport, Integration der Keratinfilamentvorl��ufer in das periphere Netzwerk, B��ndelung der Filamente, Filamentabbau in l��sliche Untereinheiten und Neubeginn des Zyklus in der Zellperipherie. Eine St��rung dieses Zyklus liegt bei mutierten Keratinen vor, welche die Ursache von Blasen-bildenden Hauterkrankungen sind. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel von Keratin 6a-Mutanten, welche die Hauterkrankung Pachyonychia congenita verursachen, gezeigt, dass bei diesen Keratinen die Nukleation zwar im Bereich der Adh��sionskomplexe regelrecht abl��uft, die anschlie��ende Elongation und Netzwerkbildung aber gest��rt ist, so dass statt dessen kurzlebige, hyperphosphorylierte Granula entstehen. Der resultierende frustrane Keratin-Zyklus in der Zellperipherie ist stark beschleunigt und kann durch p38-Inhibierung gestoppt werden. Bei Proteasomeninhibierung wird der Zyklus in Richtung der Granulabildung verschoben. In dieser Arbeit wird erstmals das Keratin-Tretm��hlen-Modell vorgestellt, das den regulierbaren Auf- und Abbau-Zyklus des Keratinnetzwerks beschreibt. Damit liegen testbare Hypothesen f��r die Aufkl��rung der Keratinfilament-Plastizit��t in physiologischen und pathologischen Situationen vor, die nach unseren ersten Ergebnissen auch von Relevanz f��r andere Intermedi��rfilamenttypen sind.

Neue 18 F-markierte Liganden zur Visualisierung des GABA A, alpha 5-Rezeptorstatus mittels PET

Die heutige Verf��gbarkeit der molekularen Bildgebung erm��glicht einen signifikanten Einfluss auf die Diagnostik und die Therapiekontrolle von neurodegenerativen Erkrankungen, die unter anderem durch Fehlsteuerungen im GABAergen System auftreten k��nnen. Die Visualisierung und Quantifizierung des GABAA-alpha5-Subtyps durch PET k��nnte dabei zu einem besseren Verst��ndnis von Erkrankungen wie Alzheimer und traumatischen Neurosen (emotionales Langzeitged��chtnis) beitragen. Ferner er��ffnen GABAA/alpha5-subtypselektive Liganden die M��glichkeit, wesentliche Grundlagen der elementaren Vorg��nge von Lernen und Erinnern zu untersuchen. 7,8,9,10-Tetrahydro-(7,10-ethan)-1,2,4-triazol[3,4-alpha]phthalazine stellen sich als vielverspre-chende Leitstrukturen zur Entwicklung neuer 18F-markierter alpha5-subtypselektiver GABAA-Rezeptorliganden f��r die PET dar. Um diese neuartigen Substanzen hinsichtlich ihrer Potenz als GABAA-alpha5-subtypselektive Radioliganden zu verifizieren, wurden zun��chst die entsprechenden 19F-Derivate TC07-TC12 synthetisiert. Diese Referenzverbindungen wurden in Rezeptor-bindungsassays und in Autoradiographien mit [3H]Ro 15-4513 als zu verdr��ngender Radioligand evaluiert. In beiden Experimenten als auch in in vivo-Verdr��ngungsexperimenten an Ratten konnte eine hohe Affinit��t im nanomolaren Bereich als auch eine hohe Selektivit��t bez��glich der GABAA/alpha5-Untereinheit f��r einige der dargestellten Referenzverbindungen nachgewiesen werden. Gem���� diesen vielversprechenden Ergebnissen wurden verschiedene Markie-rungsvorl��ufer f��r eine 18F-Direktmarkierung der relevantesten Substanz TC07 in einer mehrstufigen organischen Synthese dargestellt. Die anschlie��ende 18F-Markierung erfolgte ��ber eine nukleophile Substitution mit [18F]Fluorid. Die Reaktionsparameter wurden hinsichtlich Reaktionstemperatur und dauer, Markierungsvorl��uferkonzentration, Basenabh��ngigkeit und verschiedenen Markierungsmethoden optimiert. Daraus resultierend konnte [18F]TC07 mit bis zu 45 % radiochemischer Ausbeute erhalten werden. Die zerfallskorrigierte, gesamtradiochemische Ausbeute von nca [18F]TC07 in isotonischer NaCl-L��sung betrug 15 %. Basierend auf den bisher erhaltenen Ergebnissen wurde der Radioligand in in vitro-, ex vivo- und in vivo ��PET-Experimenten evaluiert. Die zun��chst durchgef��hrten in vitro-Experimente deuteten auf eine homogene Verteilung der Aktivit��t hin und zeigten keine spezifische Anreicherung. Diese Ergebnisse wurden sowohl in ex vivo- als auch in in vivo-��PET-Studien best��tigt. Auch hier konnte nur eine niedrige Aktivit��tsanreicherung, eine homogene Verteilung im gesamten Gehirn und keine ��bereinstimmung mit der bekannten GABAA/alpha5-Subtypverteilung gefunden werden. Eine im Anschluss durchgef��hrte Metabolismusstudie zeigte eine langsame Metabolisierungsrate des [18F]TC07 und auch eine Organverteilungsstudie zeigte keine au��ergew��hnlichen Anreicherungen. Aus den erhaltenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass der Radioligand [18F]TC07 kein geeigneter Tracer zur in vivo-Visualisierung der alpha5-Untereinheit des GABAA-Rezeptors ist.

Effects of metal-induced oxidative stress on endothelial cells in vitro

Aseptic loosening of metal implants is mainly attributed to the formation of metal degradation products. These include particulate debris and corrosion products, such as metal ions (anodic half-reaction) and ROS (cathodic half-reaction). While numerous clinical studies describe various adverse effects of metal degradation products, detailed knowledge of metal-induced cellular reactions, which might be important for possible therapeutic intervention, is not comprehensive. Since endothelial cells are involved in inflammation and angiogenesis, two processes which are critical for wound healing and integration of metal implants, the effects of different metal alloys and their degradation products on these cells were investigated. Endothelial cells on Ti6Al4V alloy showed signs of oxidative stress, which was similar to the response of endothelial cells to cathodic partial reaction of corrosion induced directly on Ti6Al4V surfaces. Furthermore, oxidative stress on Ti6Al4V alloy reduced the pro-inflammatory stimulation of endothelial cells by TNF-�� and LPS. Oxidative stress and other stress-related responses were observed in endothelial cells in contact with Co28Cr6Mo alloy. Importantly, these features could be reduced by coating Co28Cr6Mo with a TiO2 layer, thus favouring the use of such surface modification in the development of medical devices for orthopaedic surgery. The reaction of endothelial cells to Co28Cr6Mo alloy was partially similar to the effects exerted by Co2+, which is known to be released from metal implants. Co2+ also induced ROS formation and DNA damage in endothelial cells. This correlated with p53 and p21 up-regulation, indicating the possibility of cell cycle arrest. Since CoCl2 is used as an hypoxia-mimicking agent, HIF-1��-dependence of cellular responses to Co2+ was studied in comparison to anoxia-induced effects. Although important HIF-1��-dependent genes were identified, a more detailed analysis of microarray data will be required to provide additional information about the mechanisms of Co2+ action. All these reactions of endothelial cells to metal degradation products might play their role in the complex processes taking place in the body following metal device implantation. In the worst case this can lead to aseptic loosening of the implant and requirement for revision surgery. Knowledge of molecular mechanisms of metal-induced responses will hopefully provide the possibility to interfere with undesirable processes at the implant/tissue interface, thus extending the life-time of the implant and the overall success of metal implant applications.

Der enzymatische und anti-oxidative Mechanismus des anti-atherogenen Enzyms Paraoxonase-2

Das humane Enzym PON2 ist in eine Vielzahl pathophysiologischer Prozesse involviert und ist durch zwei Funktionen gekennzeichnet - eine enzymatische Laktonase-Aktivit��t und eine anti-oxidative Aktivit��t. Durch die Laktonase-Aktivit��t hydrolysiert PON2 vorwiegend das bakterielle Signalmolek��l 3oxoC12. PON2 ist als Bestandteil des angeborenen Immunsystems anzusehen und tr��gt wahrscheinlich zur Immunabwehr gegen Infektionen mit den human-pathogenen Pseudomonas aeruginosa Bakterien bei. Durch die anti-oxidative Aktivit��t vermindert PON2 oxidative Sch��den und verringert redox-abh��ngige pro-apoptotische Stimulation. Diese einzigartige Funktion von PON2 ist jedoch ambivalent zu betrachten, da hohe PON2-Spiegel zwar Arteriosklerose reduzieren k��nnen, aber im Verdacht stehen Tumorzellen zu stabilisieren.rnIn dieser Arbeit wurden die noch unbekannten Mechanismen und der Zusammenhang der enzymatischen und der anti-oxidativen Aktivit��t analysiert. In diesem Rahmen wurde gezeigt, dass PON2 spezifisch die Superoxidfreisetzung an Komplex I und III der Atmungskette in der inneren Mitochondrienmembran reduzieren kann. PON2 ver��nderte dabei weder die Aktivit��ten der Superoxiddismutasen noch die Cytochrom C-Expression. Weiterhin konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass PON2 O2- nicht direkt abbaut, sondern vielmehr dessen Bildung verhindert. Diese Erkenntnisse implizieren, dass PON2 die anti-oxidative Aktivit��t ��ber eine Beeinflussung des Quinon-Pools vermittelt. Anhand von verschiedenen Punktmutationen konnte gezeigt werden, dass die Histidinreste-114 und -133 f��r die Laktonase-Aktivit��t essentiell sind. Weiterhin wurden die Glykosylierungsstellen von PON2 identifiziert und gezeigt, dass die Glykosylierung, nicht aber der nat��rliche Polymorphismus Ser/Cys311 f��r die Laktonase-Aktivit��t von Bedeutung ist. Von besonderer Bedeutung ist, dass keine dieser Mutationen die anti-oxidative Aktivit��t beeinflusste, wodurch erstmals die Unabh��ngigkeit der beiden Funktionen von PON2 gezeigt werden konnte. rnEs war bekannt, dass PON2 gegen intrinsische und ER-Stress-induzierte Apoptose sch��tzt. Die Spezifit��t der anti-oxidativen / anti-apoptotischen Wirkung wurde hier an einem weiteren pathophysiologischen Modell untersucht. 7-Ketocholesterol (7-KC) ist der Hauptbestandteil des pro-arteriosklerotischen oxLDL und verursacht in Zellen des Gef����systems ER-Stress, oxidativen Stress und Apoptose. Unerwarteterweise konnte PON2 Endothelzellen nicht gegen den 7-KC-induzierten Zelltod sch��tzen. Mehrere unabh��ngige experimentelle Ans��tze belegen, dass 7-KC in Endothelzellen im Gegensatz zu Gef����muskelzellen den Zelltod ��ber Autophagie und nicht ��ber ER-Stress oder intrinsische Apoptose bewirkt. Weiterhin f��hrt 7-KC, wie auch 3oxoC12 und Thapsigargin zu einem Abbau der PON2-mRNA, die ��ber die 5���UTR der PON2-mRNA vermittelt wird. Diese Arbeit vermittelt detaillierte mechanistische Einsichten in die Funktionen von PON2, die f��r ihre Rolle bei Arteriosklerose, in der k��rpereigenen Immunabwehr und bei Krebs entscheidend sind.rn