Transgene Mausmodelle zur Untersuchung von Nervenzellwanderungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden transgene Mausmodelle hergestellt, die eine weitere Aufklärung der Rolle des Transkriptionsfaktors Pax6 bei der Wanderung von Nervenzellen ermöglichen, sowie ein Kultursystem zur Darstellung embryonaler Wanderungen außerhalb des Mutterleibs entwickelt.Bei der YAC-transgenen Mäuselinie PhPax6-taulacZ wird das Reportergen taulacZ unter der Kontrolle des Pax6-Promotors exprimiert. Dadurch ist dort, wo Pax6 im Zellkern vorliegt, der Rest der Zelle über seine gesamte Ausdehnung mit der vom taulacZ-Transgen kodierten tau-b-Galactosidase markiert. Das räumlich-zeitliche Expressionsmuster von Pax6 und dem Transgen taulacZ wurde detailliert untersucht. Dabei wurde eine hohe Übereinstimmung festgestellt. Basierend auf der Darstellung der Zellen in ihrer gesamten Ausdehnung, die durch das taulacZ-Transgen erstmals möglich ist, wurde eine Klassifizierung Pax6-positiver Zelltypen vorgenommen. Zunächst wird Pax6 in Neuroepithelzellen, später in radialen Gliazellen exprimiert.Mit der zweiten transgenen Mäuselinie, PhPax6-tTA, wurde ein Werkzeug hergestellt, das die gezielte und hoch spezifische Expression von beliebigen Transgenen in Pax6-exprimierenden Zellen ermöglicht. In Pax6-positive Zellen der Medulla wurde das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) eingeführt und das Wanderungsverhalten in vitro über mehrere Tage dargestellt. Erstmals können mit dieser Linie beliebige Expressionskonstrukte gezielt, hocheffizient und schnell in wandernde Neurone eingebracht werden, ohne störende Hinter-grundexpression in anderen Zellen.

Entwicklung der zeitaufgelösten Photoemissions-Elektronenmikroskopie für die Untersuchung der Magnetisierungsdynamik von mikrostrukturierten magnetischen Schichten

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die zeitaufgelöste Photoemissions Elektronenmikroskopie (TR-PEEM) für die in-situ Untersuchung ultraschneller dynamischer Prozesse in dünnen mikrostrukturierten magnetischen Schichten während eines rasch verändernden externen Magnetfelds entwickelt. Das Experiment basiert auf der Nutzung des XMCD-Kontrasts (X-ray magnetic circular dichroism) mit Hilfe des zirkularpolarisierten Lichts von Synchrotronstrahlungsquellen (Elektronenspeicherringen BESSY II (Berlin) und ESRF (Grenoble)) für die dynamische Darstellung der magnetischen Domänen während ultraschneller Magnetisierungsvorgänge. Die hier entwickelte Methode wurde als erfolgreiche Kombination aus einer hohen Orts- und Zeitauflösung (weniger als 55 nm bzw. 15 ps) realisiert. Mit der hier beschriebenen Methode konnte nachgewiesen werden, dass die Magnetisierungsdynamik in großen Permalloy-Mikrostrukturen (40 µm x 80 µm und 20 µm x 80 µm, 40 nm dick) durch inkohärente Drehung der Magnetisierung und mit der Bildung von zeitlich abhängigen Übergangsdomänen einher geht, die den Ummagnetisierungsvorgang blockieren. Es wurden neue markante Differenzen zwischen der magnetischen Response einer vorgegebenen Dünnfilm-Mikrostruktur auf ein gepulstes externes Magnetfeld im Vergleich zu dem quasi-statischen Fall gefunden. Dies betrifft die Erscheinung von transienten raumzeitlichen Domänenmustern und besonderen Detailstrukturen in diesen Mustern, welche im quasi-statischen Fall nicht auftreten. Es wurden Beispiele solcher Domänenmuster in Permalloy-Mikrostrukturen verschiedener Formen und Größen untersucht und diskutiert. Insbesondere wurde die schnelle Verbreiterung von Domänenwänden infolge des präzessionalen Magnetisierungsvorgangs, die Ausbildung von transienten Domänenwänden und transienten Vortizes sowie die Erscheinung einer gestreiften Domänenphase aufgrund der inkohärenten Drehung der Magnetisierung diskutiert. Ferner wurde die Methode für die Untersuchung von stehenden Spinwellen auf ultradünnen (16 µm x 32 µm groß und 10 nm dick) Permalloy-Mikrostrukturen herangezogen. In einer zum periodischen Anregungsfeld senkrecht orientierten rechteckigen Mikrostruktur wurde ein induziertes magnetisches Moment gefunden. Dieses Phänomen wurde als „selbstfangende“ Spinwellenmode interpretiert. Es wurde gezeigt, dass sich eine erzwungene Normalmode durch Verschiebung einer 180°-Néelwand stabilisiert. Wird das System knapp unterhalb seiner Resonanzfrequenz angeregt, passt sich die Magnetisierungsverteilung derart an, dass ein möglichst großer Teil der durch das Anregungsfeld eingebrachten Energie im System verbleibt. Über einem bestimmten Grenzwert verursacht die Spinwellenmode nahe der Resonanzfrequenz eine effektive Kraft senkrecht zur 180°-Néel-Wand. Diese entsteht im Zentrum der Mikrostruktur und wird durch die streufeldinduzierte Kraft kompensiert. Als zusätzliche Möglichkeit wurden die Streufelder von magnetischen Mikrostrukturen während der dynamischen Prozesse quantitativ bestimmt und das genaue zeitliche Profil des Streufelds untersucht. Es wurde gezeigt, dass das zeitaufgelöste Photoemissions Elektronenmikroskop als ultraschnelles oberflächensensitives Magnetometer eingesetzt werden kann.

Entschlüsselung des Carotinoid-Metabolismus im marinen Schwamm Suberites domuncula

Die Enzyme des Carotinoidstoffwechsels spalten Provitamin A-Carotinoide in wichtige Retinoide (z.B. Vitamin A, Retinsäure), die Organismen während der Entwicklung und in visuellen Systemen benötigen. Die vorliegende Arbeit präsentiert erstmalig eine Carotinoxygenase (BCO) aus Schwämmen (S. domuncula), die einzigartig im Tierreich ist und nur einen orthologen Vertreter in Pflanzen (Crocus sativus) wieder findet. Das Enzym ist eine 7,8(7’,8’)-Carotinoxygenase, die C40-Carotinoide zu einem C10-Apocarotinoid und 8’-Apocarotinal spaltet. Mittels HPLC wurden sowohl die Primärspaltprodukte von β-Carotin, Lykopin und Zeaxanthin als auch das für alle identische innere Kettenstück (Crocetin) bei Doppelspaltung nachgewiesen. Der Nachweis der BCO-Transkripte (unter anderem in-situ) belegt eine Beteiligung des Enzyms während Entwicklungsprozessen und offenbart sowohl eine streng räumlich-zeitliche als auch eine über Rückkopplungsprozesse gesteuerte Regulierung des Enzyms. Ein weiteres hier identifiziertes Gen ähnelt einer bakteriellen Apocarotinoidoxygenase (ACO), welche das 8’-Apocarotinal der BCO erneut spaltet und so Retinal generiert. Letzteres dient als Chromophor zahlreicher visueller Systeme und kann über Enzyme des Retinoidstoffwechsels entweder gespeichert, oder in das wichtige Morphogen Retinsäure umgesetzt werden. Hier werden zwei potentielle Enzyme vorgestellt, die an dieser Interkonversion Retinal/Retinol (Speicher) beteiligt sein könnten als auch eines, das evtl. Retinal zu Retinsäure umsetzt. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Retinsäure kein autapomorphes Morphogen der Chordaten darstellt.

Neural network activity in the neonatal acute slice, slice culture and cell culture

Information processing and storage in the brain may be presented by the oscillations and cell assemblies. Here we address the question of how individual neurons associate together to assemble neural networks and present spontaneous electrical activity. Therefore, we dissected the neonatal brain at three different levels: acute 1-mm thick brain slice, cultured organotypic 350-µm thick brain slice and dissociated neuronal cultures. The spatio-temporal properties of neural activity were investigated by using a 60-channel Micro-electrode arrays (MEA), and the cell assemblies were studied by using a template-matching method. We find local on-propagating as well as large- scale propagating spontaneous oscillatory activity in acute slices, spontaneous network activity characterized by synchronized burst discharges in organotypic cultured slices, and autonomous bursting behaviour in dissociated neuronal cultures. Furthermore, repetitive spike patterns emerge after one week of dissociated neuronal culture and dramatically increase their numbers as well as their complexity and occurrence in the second week. Our data indicate that neurons can self-organize themselves, assembly to a neural network, present spontaneous oscillations, and emerge spatio-temporal activation patterns. The spontaneous oscillations and repetitive spike patterns may serve fundamental functions for information processing and storage in the brain.

Hox genes and the regulation of programmed cell death in the embryonic central nervous system of Drosophila melanogaster

This study deals with the function and regulation of programmed cell death, or apoptosis, in the development of the embryonic central nervous system of Drosophila melanogaster. The first part provides a description of apoptosis-deficient embryos, which showed that preventing apoptosis does not cause gross morphological defects in the CNS, as it appears well organized despite the presence of too many cells. An analysis of the incidence and pattern of apoptosis over the course of development discloses a partly very orderly pattern suggesting tight spatio-temporal control, but also reveals random apoptotic cells, which suggests a certain amount of plasticity in the embryo. This analysis also allowed precise identification of some of the dying neural cells in the embryo, and establishment of single cell models for studying regulation of segment-specific apoptosis in the embryonic CNS. In the second part of the work, further investigations into mechanisms controlling segment-specific apoptosis revealed the involvement of two Hox genes, Antennapedia (Antp) and Ultrabithorax (Ubx), in this process. Hox genes control the formation of segment-specific structures in their domains of expression, but also regulate organ and tissue morphogenesis. The study presented here shows that Antp and Ubx play antagonistic roles in motoneuron survival in the embryo. Ubx expression in the CNS is strongly upregulated at a late point in development, when most cells have begun to differentiate. This upregulation shortly precedes Ubx-dependent, segment-specific apoptosis of two differentiated motoneurons. It could further be demonstrated that Antp is required for proper development of the NB7-3 lineage and for survival of the NB7-3 motoneuron in the anterior thoracic segments. In segments where Antp and Ubx expression overlaps, Ubx counteracts the anti-apoptotic function of Antp, resulting in cell death. Thus, these two Hox genes play opposing roles in the survival of differentiated neurons in the late developing nervous system. They thereby contribute to establishment of correct connections between outward-projecting neurons and their targets, which is crucial for the assembly of functional neural circuits, as these have to fulfill region-specific locomotion and sensory requirements along the antero-posterior body axis.