Aussagekraft einer quantitativen, PC-unterstützten PCNA-Bestimmung an Leiomyosarkomen und Leiomyomen

Ziel der Studie war die Untersuchung inwieweit PCNA als immunhistochemisches Hilfsmittel eine Verbesserung der Abgrenzung von uterinen LM gegenüber uterinen LMS und eine Hilfe bei der Prognoseaussage bei uterinen und gastrointestinalen LMS darstellt. Dabei wurden auch weitere, herkömmliche, in einer Reihe von Studien untersuchte Prognoseparameter mit in Betracht gezogen.rnDie Auswertung der Färbungen erfolgte quantitativ mittels einer PC-gesteuerten Bildverarbeitung, die neben der positiven Zellfläche und Zellzahl auch die Kernfläche berechnet. Vorteil der quantitativen Messung ist die Möglichkeit der Reproduzierbarkeit unabhängig vom Benutzer, im Gegensatz zu semiquantitativen Analysen, die häufiger angewendet werden.rnEs fällt dabei auf, dass sowohl die Zellkerngröße generell als auch die Zellkerngröße der positiv gefärbten Zellen signifikant größer bei LMS als bei LM ist. (p< 0,0001). Zwischen den Zellkerngrößen der uterinen und der gastrointestinalen LMS fanden sich keine signifikanten Unterschiede.rnBezüglich der Abgrenzung zwischen uterinen LM und LMS zeigten sich signifikant höhere PCNA-Meßwerte für LMS (mittlere positive Zellkernzahl 15,08%, mittlere positive Zellkernzahl 16,67%) gegenüber LM (mittlere positive Zellkernzahl 1,95%, mittlere positive Zellkernzahl 2,02%). Zu den gastrointestinalen LMS-PCNA Messwerten gab es keinen signifikanten Unterschied (mittlere positive Zellkernfläche 19,07%, mittlere positive Zellkernzahl 16,43).rnKein signifikanter Zusammenhang zeigte sich bei der Höhe der PCNA-Meßwerte und der Prognose sowohl der uterinen als auch der gastrointestinalen LMS.rnIn dieser Studie stellten sich als signifikant prognoserelevant lediglich das Alter sowohl bei den uterinen und gastrointestinalen LMS heraus. Bei den uterinen LMS war auch noch ein schlechteres Grading und das Vorhandensein von Nekrosen signifikant mit der Prognose korreliert.rnNicht signifikant prognoserelevant waren sowohl bei den uterinen wie den gastrointestinalen LMS die Tumorgröße und die PCNA-Meßwerthöhe. Bei den gastrointestinalen Leiomyosarkomen zusätzlich noch das Vorhandensein von Nekrosen.rnEin signifikanter Zusammenhang wurde zwischen PCNA-Meßwerten und der Uterusgröße bzw. auch der Myomgröße bei den uterinen Leiomyomen sowie analog der Tumorgröße der uterinen und der gastrointestinalen LMS festgestellt. Innerhalb der Gruppe der uterinen Myome zeigten sich für zellreiche Myome zwar höhere Messwerte, die jedoch nicht signifikant waren.rnKein Zusammenhang zeigte sich dagegen für die Höhe der PNCA-Meßwerte und dem Grading der uterinen sowohl als auch der gastrointestinalen Leiomyosarkome, dem Alter der Patientinnen bei den uterinen LMS, dem Vorhandensein von Nekrosen bei den uterinen sowohl als auch bei gastrointestinalen LMS und dem Geschlecht bei den gastrointestinalen LMS.rnDie Ergebnisse stehen bezüglich der Aussage der Prognose teilweise in Widerspruch, teilweise in Einklang mit den bisherigen Veröffentlichungen. Ein großes Hemmnis ist die geringe Fallzahl, die vor allem durch die Seltenheit der Tumore bedingt ist, desweiteren die ungenügende Nachverfolgung der Patienten, die auch daraus resultiert, dass es sich um eine retrospektive Studie handelt. Hier bedarf es größerer Studien, möglicherweise als multizentrische Studien mit genauer Verlaufsbeobachtung, um auch im deutschsprachigen Raum eine weitere Erforschung dieser seltenen, umsomehr sehr interessanten und an den untersuchenden Pathologen besondere Ansprüche stellende Tumore zu geben.rn

Analyse der intrazellulären Freisetzung von Wirkstoffmodellen via konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, wie man das Potential nanopartikulärer Systeme, die vorwiegend via Miniemulsion hergestellt wurden, im Hinblick auf „Drug Delivery“ ausnutzen könnte, indem ein Wirkstoffmodell auf unterschiedliche Art und Weise intrazellulär freigesetzt wurde. Dies wurde hauptsächlich mittels konfokaler Laser-Raster-Mikrokopie (CLSM) in Kombination mit dem Bildbearbeitungsprogramm Volocity® analysiert.rnPBCA-Nanokapseln eigneten sich besonders, um hydrophile Substanzen wie etwa Oligonukleotide zu verkapseln und sie so auf ihrem Transportweg in die Zellen vor einem etwaigen Abbau zu schützen. Es konnte eine Freisetzung der Oligonukleotide in den Zellen aufgrund der elektrostatischen Anziehung des mitochondrialen Membranpotentials nachgewiesen werden. Dabei war die Kombination aus Oligonukleotid und angebundenem Cyanin-Farbstoff (Cy5) an der 5‘-Position der Oligonukleotid-Sequenz ausschlaggebend. Durch quantitative Analysen mittels Volocity® konnte die vollständige Kolokalisation der freigesetzten Oligonukleotide an Mitochondrien bewiesen werden, was anhand der Kolokalisationskoeffizienten „Manders‘ Coefficients“ M1 und M2 diskutiert wurde. Es konnte ebenfalls aufgrund von FRET-Studien doppelt markierter Oligos gezeigt werden, dass die Oligonukleotide weder beim Transport noch bei der Freisetzung abgebaut wurden. Außerdem wurde aufgeklärt, dass nur der Inhalt der Nanokapseln, d. h. die Oligonukleotide, an Mitochondrien akkumulierte, das Kapselmaterial selbst jedoch in anderen intrazellulären Bereichen aufzufinden war. Eine Kombination aus Cyanin-Farbstoffen wie Cy5 mit einer Nukleotidsequenz oder einem Wirkstoff könnte also die Basis für einen gezielten Wirkstofftransport zu Mitochondrien liefern bzw. die Grundlage schaffen, eine Freisetzung aus Kapseln ins Zytoplasma zu gewährleisten.rnDer vielseitige Einsatz der Miniemulsion gestattete es, nicht nur Kapseln sondern auch Nanopartikel herzustellen, in welchen hydrophobe Substanzen im Partikelkern eingeschlossen werden konnten. Diese auf hydrophobe Wechselwirkungen beruhende „Verkapselung“ eines Wirkstoffmodells, in diesem Fall PMI, wurde bei PDLLA- bzw. PS-Nanopartikeln ausgenutzt, welche durch ein HPMA-basiertes Block-Copolymer stabilisiert wurden. Dabei konnte gezeigt werden, dass das hydrophobe Wirkstoffmodell PMI innerhalb kürzester Zeit in die Zellen freigesetzt wurde und sich in sogenannte „Lipid Droplets“ einlagerte, ohne dass die Nanopartikel selbst aufgenommen werden mussten. Daneben war ein intrazelluläres Ablösen des stabilisierenden Block-Copolymers zu verzeichnen, welches rn8 h nach Partikelaufnahme erfolgte und ebenfalls durch Analysen mittels Volocity® untermauert wurde. Dies hatte jedoch keinen Einfluss auf die eigentliche Partikelaufnahme oder die Freisetzung des Wirkstoffmodells. Ein großer Vorteil in der Verwendung des HPMA-basierten Block-Copolymers liegt darin begründet, dass auf zeitaufwendige Waschschritte wie etwa Dialyse nach der Partikelherstellung verzichtet werden konnte, da P(HPMA) ein biokompatibles Polymer ist. Auf der anderen Seite hat man aufgrund der Syntheseroute dieses Block-Copolymers vielfältige Möglichkeiten, Funktionalitäten wie etwa Fluoreszenzmarker einzubringen. Eine kovalente Anbindung eines Wirkstoffs ist ebenfalls denkbar, welcher intrazellulär z. B. aufgrund von enzymatischen Abbauprozessen langsam freigesetzt werden könnte. Somit bietet sich die Möglichkeit mit Nanopartikeln, die durch HPMA-basierte Block-Copolymere stabilisiert wurden, gleichzeitig zwei unterschiedliche Wirkstoffe in die Zellen zu bringen, wobei der eine schnell und der zweite über einen längeren Zeitraum hinweg (kontrolliert) freigesetzt werden könnte.rnNeben Nanokapseln sowie –partikeln, die durch inverse bzw. direkte Miniemulsion dargestellt wurden, sind auch Nanohydrogelpartikel untersucht worden, die sich aufgrund von Selbstorganisation eines amphiphilen Bock-Copolymers bildeten. Diese Nanohydrogelpartikel dienten der Komplexierung von siRNA und wurden hinsichtlich ihrer Anreicherung in Lysosomen untersucht. Aufgrund der Knockdown-Studien von Lutz Nuhn konnte ein Unterschied in der Knockdown-Effizienz festgestellt werden, je nach dem, ob 100 nm oder 40 nm große Nanohydrogelpartikel verwendet wurden. Es sollte festgestellt werden, ob eine größenbedingte, unterschiedlich schnelle Anreicherung dieser beiden Partikel in Lysosomen erfolgte, was die unterschiedliche Knockdown-Effizienz erklären könnte. CLSM-Studien und quantitative Kolokalisationsstudien gaben einen ersten Hinweis auf diese Größenabhängigkeit. rnBei allen verwendeten nanopartikulären Systemen konnte eine Freisetzung ihres Inhalts gezeigt werden. Somit bieten sie ein großes Potential als Wirkstoffträger für biomedizinische Anwendungen.rn