The role of Interleukin-12 in liver inflammation

Chronic liver inflammation during viral hepatitis is a major health problem worldwide. The role of proinflammatory cytokines, like IL-12, in breaking hepatic immune tolerance, and inducing acute liver inflammation and virus clearance is not clear. Nor is clear its role in uncontrolled severe inflammatory response, leading to fulminant hepatitis and hepatic failure. This work, focused in the study of the role of endogenous produced IL-12 in inducing hepatic inflammatory responses, demonstrates: In vitro, using adenovirus coding for IL-12, that hepatocytes stimulate CD4+ T cells in a tolerogenic manner, and that endogenous IL-12 is able to switch the immune response into Th1; and in vivo, that endogenous IL-12 induces hepatocyte damage and virus elimination in mice infected with adenovirus. In addition, and in order to study in vivo the relevance of IL-12 in acute inflammation, conditional IL-12 transgenic mice expressing IL-12 in the liver after cre-recombinase mediated induction were generated. For this purpose, an IL-12 fusion protein was created, which demonstrated high levels of bioactivity. Induction of IL-12 expression during embryonic development was achieved by crossbreeding with Act-Cre transgenic mice; induction of IL-12 expression in adult mice was achieved by a plasmid coding for the cre-recombinase. This study demonstrates that after induction, IL-12 is expressed in the liver of the transgenic mice. It also demonstrates that hepatic expression of IL-12 induces splenomegaly and liver inflammation, characterized by large infiltrations in portal tracts and veins, associated with hepatic damage, necrosis areas and lethality. Furthermore, constitutive hepatic IL-12 expression does not lead to abortion, but to total lethality, short after delivery. In conclusion, in this study, a transgenic mouse model has been generated, in which the expression of active IL-12 in the liver can be induced at any time; this model will be very helpful for studying hepatic pathologies. This study has also demonstrated that hepatic produced IL-12 is able of breaking liver tolerance inducing inflammation, virus elimination, severe hepatocyte damage, and lethality. These findings suggest IL-12 as a key cytokine in acute liver inflammation and fulminant hepatic failure. 5.1 Future studies Once the importance of IL-12 in inducing hepatic inflammation and virus elimination was demonstrated in this study, understanding the mechanisms of the IL-12 induced liver damage, and more important, how to avoid it will be the main focus in the future. It is very important to achieve hepatic inflammation for a more effective and faster viral elimination, but avoiding the toxicity of IL-12, which leads to massive liver injury and lethality is obviously necessary to allow IL-12 as therapy. For that purpose, future studies will be mainly base on three different points: 1. The determination of different cell populations present in the hepatic infiltration, which of them are responsible for liver injury, and as well their state of activation. 2. The measure of other pro- and anti-inflammatory cytokines and chemokines, which can play a role in IL-12-induced liver inflammation and hepatocyte damage. For these purposes, specific blocking antibodies (anti TNF-alpha, anti IL-12, anti IFN-g) will be used. The study with different transgenic mice: TNF-alpha Receptor knockout, TGF-b, will also help in determining the role of those cytokines during IL-12-induced liver damage and lethality. 3. The establishing of liver pathology models (viral infection, tumours, auto-antigens) in mice. Induction of IL-12 at any time of the pathology development will help in clarifying the role of IL-12 in those models. Finally, the transgenic mice expressing IL-23 in the liver will be generated.

Leishmania major promastigote entry of an autophagy-like compartment and amastigote escape from the parasitophorous vacuole

In this thesis, we investigated the interaction of the obligate intracellular parasite Leishmania (L.) major with two phenotypes of human monocyte derived macrophages (hMDMs). Thereby we focused on the development and maturation of the parasitophorous vacuole (PV) and could show that compartment development is dependent on the parasite stage.rnFocusing on the ultrastructure of PVs containing axenic amastigotes, we demonstrated that the parasites are partially located in damaged PVs or in the cytoplasm of the host. Moreover, we visualized multiple amastigotes in a common PV 144 h p.i. in pro-inflammatory hMDM I but not in anti-inflammatory hMDM II indicating different PV development. rnRegarding the promastigote form, we demonstrated a different uptake of viable and apoptotic L. major promastigotes by hMDMs. Viable promastigotes are predominantly taken up via the flagellum tip whereas apoptotic promastigotes enter the cells via the parasite body. Analyzing compartment maturation, we found that 20-30% of the PVs get positive for the early maturation markers PI3P and EEA1 independent of the viability of the parasites and unaffected by the human macrophage type. Subsequently, 25-40% of the parasites acquire the autophagy marker LC3 on their PV, what is independent of the viability of the parasites as well. We quantified this and in hMDM II less LC3-positive compartments formed compared to hMDM I. Analyzing the ultrastructure, we investigated that the compartments consist of a single-membrane PV characteristic for LC3-associated phagocytosis (LAP). Involvement of LAP was confirmed by demonstrating that the protein kinase ULK1 is dispensable for LC3-compartment formation around Leishmania PVs. Visualizing compartment dynamics in real time showed that apoptotic promastigotes are degraded in LC3-positve compartments, whereas viable promastigotes are able to get rid of LC3-protein on their PV suggesting an involvement in parasite development and survival. In this thesis, we established a lentiviral based fluorescent imaging technique that we combined with High-Pressure-Freezing (HPF) and high-resolution 3D electron microscopy. We visualized a promastigote in a LC3-compartment whose ultrastructure showed an opening of the PV to the outside. To identify new LAP markers involved in Leishmania infection, we established an immuno-magnetic isolation protocol for the purification of Leishmania containing compartments.rnIn conclusion, this study suggests that L. major compartment biogenesis and maturation in pro- and anti-inflammatory human macrophages is dependent on the parasite stage and is different between axenic amastigotes, viable promastigotes and apoptotic promastigotes. Understanding the development and maturation of Leishmania parasites in human host cells is important to control and combat the neglected disease leishmaniasis in the future.rn

Die Rolle von Interleukin-22 bei Asthma bronchiale

Interleukin (IL)-22 ist ein Effektorzytokin, das von Zellen des Immunsystems produziert wird und auf Epithelzellen wirkt. Es nimmt eine duale Rolle ein, indem es abhängig vom Gewebe und Zytokinmilieu entweder entzündungsfördernden oder entzündungshemmenden Einfluss ausübt. Über seine Wirkung bei Asthma bronchiale ist bislang noch wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten in einem murinen Modell der allergischen Atemwegsentzündung lymphoide Zellen des angeborenen Immunsystems als Hauptproduzenten für IL-22 detektiert werden, die bislang noch nicht im Zusammenhang mit Asthma bronchiale beschrieben wurden. Es konnte gezeigt werden, dass IL-22- defiziente Mäuse eine verstärkte Atemwegsentzündung entwickelten und sich die IL-22-Defizienz in diesem Modell entzündungsfördernd auf die induzierte Atemwegsentzündung auswirkte. Mit Hilfe einer murinen bronchialen Epithelzelllinie wurden die Mechanismen des IL-22 und die Expression Asthma-relevanter Mediatoren untersucht. Der beobachtete inhibierende IL-22-Effekt ließ sich mit Hilfe seines natürlichen Antagonisten IL-22BP neutralisieren. Diese entzündungshemmende Wirkung des IL-22 konnte ebenfalls in Wildtyp-Mäusen, denen rekombinantes IL-22 intratracheal verabreicht worden war, bestätigt werden.

Effects of glucocorticoids on vascular NADPH oxidases and endothelial NO synthase

Glukokortikoide (GCs) stellen wichtige Hormone in der Regulation der metabolischen Homöostase dar. Synthetische GCs, wie Dexamethasone (DEX), spielen eine essentielle Rolle in der Behandlung inflammatorischer Krankheiten. Jedoch sind unter einer Dexamethason-Therapie zahlreiche Nebenwirkungen bekannt, so z.B. auch die Entwicklung einer Hypertonie, in deren Pathogenese oxidativer Stress eine entscheidende Rolle spielt. Obwohl sich in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien zum Ziel setzten die GC-induzierte Hypertonie (GC-HT) aufzuklären, sind die genauen Mechanismen bis heute unklar. Eine erhöhte Expression von NADPH Oxidasen (Nox) und eine Entkopplung der endothelialen NO Synthase (eNOS), die Hauptquellen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im vaskulären System, tragen maßgeblich zur Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen bei. Daher ist eine Beteiligung dieser Enzyme in GC-induziertem oxidativen Stress sehr wahrscheinlich. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NADPH Oxidasen und eine entkoppelte eNOS die vielversprechendsten unter den zahlreichen involvierten pro- und anti-oxidativen Enzymen sind. Mit Fokus auf die oben genannten Systeme wurde in der vorliegenden Studie der Effekt von DEX mit Hilfe von in vivo (WKY Ratten) ebenso wie in vitro Experimenten (A7r5 und EA.hy 926 Zellen) untersucht. Dabei zeigte sich, dass Nox1, Nox4 und p22phox durch DEX unterschiedlich reguliert wurden. Nox1 wurde hoch-, Nox4 hingegen herunterreguliert, während p22phox unverändert blieb. Die Modufikation schien hierbei auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene stattzufinden. Durch die gegensätzliche Regulation von Nox1 und Nox4 bleibt die Nettowirkung der verschiedenen Nox Isoformen unklar. Immer mehr Studien bringen vaskulären oxidativen Stress mit der Pathogenese einer GC-HT in Zusammenhang, welche letztendlich zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) führt. Durch die eNOS produziertes NO stellt einen essentiellen Schutzfaktor der Blutgefäße dar. Eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit könnte die Folge einer eNOS-Entkopplung darstellen, ausgelöst durch oxidativen Stress. Da die Verfügbarkeit von Tetrahydrobiopterin (BH4) entscheident ist für die Aktivität und enzymatische Kopplung der eNOS, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit GC-induzierten Veränderungen in der BH4-Versorgung. Die Behandlung von EA.hy 926 Zellen mit DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von eNOS auf mRNA- und Proteinebene. Gleichzeitig wurde die Phosphorylierung an Serine1177 vermindert. Als maßgeblicher “Kopplungs-Schalter” kann BH4 endogen über zwei verschiedene Signalwege synthetisiert werden, welche durch die Enzyme GCH1 und DHFR reguliert werden. DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von BH4, BH2 und Biopterin, wobei ebenso das BH4 / BH2 -Verhältnis vermindert wurde. Beide Enzyme, GCH1 genauso wie DHFR, wurden auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert, was auf einen Effekt von GCs auf beide rnBH4-produzierenden Signalwege schließen lässt. Nach Behandlung mit DEX wurde die Produktion von NO in Endothelzellen maßgeblich vermindert. In ROS-Messungen zeigte sich eine Tendenz hin zu einer eNOS-Entkopplung, jedoch war es mit unserem experimentellen Aufbau nicht möglich, diese endgültig zu beweisen.rnZusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung mit GCs zu Veränderungen in beiden untersuchten Systemen, den NADPH Oxidasen ebenso wie dem eNOS-NO System, führte. DEX erhöhte die Expression von Nox1 in glatten Muskelzellen und reduzierte die Nox4-Expression in Endothelzellen. Gleichzeitig verminderte DEX die Verfügbarkeit von BH4 und inhibierte die Phosphorylierung / Aktivität von eNOS. Mithilfe weiterer Studien muss die endgültige Beteiligung von NADPH Oxidasen und einer eNOS-Entkopplung an oxidativem Stress in GC-HT abschließend aufgeklärt werden.rn

Leishmania major parasites and their interaction with human macrophages

First both life stages of Leishmania major (L. major) FEBNI parasites, promastigotes as well as amastigotes, were characterized. We found that the virulence marker GP63 and cysteine peptidase b (Cpb) were higher expressed by axenic amastigotes as compared to promastigotes. In addition to the L. major FEBNI strain, we applied and successfully modified our novel in vitro method to generate axenic amastigotes of the L. major Friedlin and 5ASKH strains. Interestingly, these L. major strains needed another temperature to be transferred into amastigotes in the axenic culture system. Investigating apoptosis mechanisms in both parasite life stages of L. major FEBNI we found both ROS dependent and independent cell death mechanisms. Focusing on promastigote and amastigote interaction with pro-inflammatory (MF I) and anti-inflammatory (MF II) macrophages we found amastigotes to be more infective as compared to promastigotes. Moreover, we could demonstrate that pro-inflammatory MF I were less susceptible to infection than anti-inflammatory MF II. Finally we investigated parasite stage-specific responses of MF I + II and their defense mechanisms against L. major. Using knockdown techniques for primary human macrophages we identified a new mechanism enabling intracellular killing of promastigotes inside MF I. This mechanism depends on the antimicrobial molecule cathelicidin (LL-37).