Asynchrone Replikation geprägter und nicht geprägter Chromosomenregionen und Expression relevanter Entwicklungsgene in Präimplantationsembryonen der Maus

Zum besseren Verständnis der epigenetischen Reprogrammierung nach der Befruchtung, wurde in der vorliegenden Studie unter Verwendung eines Interphase-FISH-Assays eine systematische Analyse des Replikationsverhaltens geprägter und nicht geprägter Chromosomenregionen in Präimplantationsembryonen der Maus durchgeführt. Dabei konnte erstmalig gezeigt werden, dass sowohl geprägte als auch nicht geprägte Chromosomen-regionen direkt nach der Befruchtung asynchron replizieren. Vier von fünf nicht geprägten Chromosomenregionen replizierten erst nach dem Zweizell-Embryostadium synchron. Eine asynchrone Replikation geprägter Regionen wurde während der gesamten Präimplantationsentwicklung und in differenzierten Zellen beobachtet. In Morula-Embryonen zeigten der in diesem Stadium nicht exprimierte Dlk1-Gtl2-Locus sowie der biallelisch exprimierte Igf2r-Locus jedoch eine Relaxation der asynchronen Replikation. In einem weiteren Projekt konnte mit Hilfe eines Multiplex-RT-PCR-Ansatzes die sensitive Detektion von multiplen Transkripten in einzelnen Zellen etabliert werden. Anschließend wurden Expressionsmuster von 17 für die epigenetische Reprogrammierung relevanten Entwicklungs-genen in Präimplantationsembryonen sowie in einzelnen Morula-Blastomeren analysiert. Der Transkriptionsfaktor Pou5f1 wurde in allen Präimplantationsembryonen und allen Morula-Blastomeren detektiert, was auf eine uniforme Reaktivierung der Pluripotenz hinweist. Dagegen variierte die mRNA-Expression verschiedener DNA-Cytosin-5-Methyltransferasen, 5-methyl-CpG-Bindeproteine sowie Enzyme der Basenexzisionsreparatur stark zwischen individuellen Zellen des gleichen Embryos und noch stärker zwischen Zellen verschiedener Embryonen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich das für die Reprogrammierungsmaschinerie kodierende Transkriptom zu bestimmten Entwicklungs-zeitpunkten zwischen einzelnen Blastomeren unterscheidet.

Der Einfluss assistierter Reproduktionstechniken auf die epigenetische Reprogrammierung in der fruehen Embryogenese und Gametogenese im Mausmodell

Seit der Geburt von Louise J. Brown (1978) als erstem künstlich erzeugtem Kind hat sich die Nachfrage nach assistierten Reproduktionstechniken (ART) stark erhöht. Der Anteil der nach In-vitro-Fertilisation (IVF) oder Intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) geborenen Kinder macht mittlerweile abhängig vom betrachteten Industrieland zwischen 1-4% an der Gesamtgeburtenzahl aus. In zahlreichen Studien korreliert eine erhöhte Prävalenz für seltene Imprinting-Erkrankungen, wie z.B. Beckwith-Wiedemann oder Angelman-Syndrom, mit der Geburt nach assistierten Reproduktionstechniken. Es ist bekannt, dass die medizinischen Interventionen zur Behandlung von Sub- und Infertilität in sehr sensitive Phasen der epigenetischen Reprogrammierung des Embryos und der Keimzellen eingreifen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die ovarielle Stimulation einen Einfluss auf die epigenetische Integrität von geprägten Genen in murinen Präimplantationsembryonen hat. Die in diesem Zusammenhang entwickelte digitale Bisulfitpyrosequenzierung gewährleistet die Analyse der DNA-Methylierung auf Einzelallelebene durch eine adäquate Verdünnung der Probe im Vorfeld der PCR. Die ovarielle Induktion führte zu einem erhöhten Rate an Epimutationen des paternalen H19-Allels, sowie des maternalen Snrpn-Allels. Zudem konnte festgestellt werden, dass die Expression von drei potentiellen Reprogrammierungsgenen (Apex1, Polb, Mbd3) in Embryonen aus hormonell stimulierten Muttertieren dereguliert ist. Whole-Mount Immunfluoreszenzfärbungen für APEX1 korrelierten dessen differentielle Genexpression mit dem Proteinlevel. Anzeichen früher apoptotischer Vorgänge äußerten sich in Embryonen aus hormonell induzierten Muttertieren in der hohen Rate an Embryonen, die keines der drei Transkripte exprimierten oder weniger APEX1-positive Blastomeren aufwiesen.In einer weiteren Fragestellung wurde untersucht, ob die Kryokonservierung muriner Spermatozoen den epigenetischen Status geprägter Gene in den Keimzellen beeinflusst. Die Analyse von F1-Zweizellembryonen, die durch IVF mit den jeweiligen Spermatozoen eines Männchens generiert wurden, diente der Aufklärung möglicher paternaler Transmissionen. Insgesamt konnten keine signifikanten Auswirkungen der Kryokonservierung auf den epigenetischen Status in Spermatozoen und F1-Embryonen ermittelt werden.

Investigations on formation and specification of neural precursor cells in the central nervous system of the Drosophila melanogaster embryo

Investigations on formation and specification of neural precursor cells in the central nervous system of the Drosophila melanogaster embryoSpecification of a unique cell fate during development of a multicellular organism often is a function of its position. The Drosophila central nervous system (CNS) provides an ideal system to dissect signalling events during development that lead to cell specific patterns. Different cell types in the CNS are formed from a relatively few precursor cells, the neuroblasts (NBs), which delaminate from the neurogenic region of the ectoderm. The delamination occurs in five waves, S1-S5, finally leading to a subepidermal layer consisting of about 30 NBs, each with a unique identity, arranged in a stereotyped spatial pattern in each hemisegment. This information depends on several factors such as the concentrations of various morphogens, cell-cell interactions and long range signals present at the position and time of its birth. The early NBs, delaminating during S1 and S2, form an orthogonal array of four rows (2/3,4,5,6/7) and three columns (medial, intermediate, and lateral) . However, the three column and four row-arrangement pattern is only transitory during early stages of neurogenesis which is obscured by late emerging (S3-S5) neuroblasts (Doe and Goodman, 1985; Goodman and Doe, 1993). Therefore the aim of my study has been to identify novel genes which play a role in the formation or specification of late delaminating NBs.In this study the gene anterior open or yan was picked up in a genetic screen to identity novel and yet unidentified genes in the process of late neuroblast formation and specification. I have shown that the gene yan is responsible for maintaining the cells of the neuroectoderm in an undifferentiated state by interfering with the Notch signalling mechanism. Secondly, I have studied the function and interactions of segment polarity genes within a certain neuroectodermal region, namely the engrailed (en) expressing domain, with regard to the fate specification of a set of late neuroblasts, namely NB 6-4 and NB 7-3. I have dissected the regulatory interaction of the segment polarity genes wingless (wg), hedgehog (hh) and engrailed (en) as they maintain each other’s expression to show that En is a prerequisite for neurogenesis and show that the interplay of the segmentation genes naked (nkd) and gooseberry (gsb), both of which are targets of wingless (wg) activity, leads to differential commitment of NB 7-3 and NB 6-4 cell fate. I have shown that in the absence of either nkd or gsb one NB fate is replaced by the other. However, the temporal sequence of delamination is maintained, suggesting that formation and specification of these two NBs are under independent control.

Markierung der Zellinien im Embryo von Platynereis

Die Zellgenealogie des Polychaeten Platynereis dumerilii wurde durch Farbstoffinjektion in die Blastomeren des 2-, 4- und 8-Zellstadiums, sowie die Zellen 2d, 2d112, 4d und 4d1 untersucht. Injektionen gelangen durch Aufweichung der Vitellinhülle mittels Dithioerythritol und Trypsin. Die injizierten Keime wurden zur Trochophora bzw zum dreisegmentigen Jungwurm aufgezogen, fixiert und mit dem konfokalen Rasterlichtmikroskop dreidimensional aufgenommen. Die animal-vegetale Achse des Frühkeims entspricht der antero-posterioren Achse des Jungwurms. Die Mikromeren des ersten Quartetts sind radiär um die antero-posteriore Achse angeordnet und bilden den Kopf. Die Mikromere 2d proliferiert bilateralsymmetrisch von der dorsalen Mittellinie aus und liefert das gesamte Rumpfektoderm. Indirekt ließ sich ableiten, daß die Mikromeren 2a1 bis 2c1 schmale ektodermale Streifen zwischen Kopf und Rumpf bilden und aus 2a2 und 2c2 das ektodermale Stomodaeum hervorgeht. Die Mikromeren des dritten Quartetts sowie möglicherweise 2b2 bilden 'Ektomesoderm'. 4d proliferiert ebenfalls bilateralsymmetrisch von der dorsalen Mittellinie aus zum Rumpfmesoderm und liefert vielleicht noch kleine Beiträge zum Aufbau des Darmes. Der Mitteldarm stammt von den dotterreichen Makromeren 4A bis 4D.

Funktionelle Analyse der Gliazellwanderung im Drosophila-Embryo

Gliazellen kommen in allen höheren Organismen vor und sind sowohl für die korrekte Entwicklung, als auch für die Funktionalität des adulten Nervensystems unerlässlich. Eine der mannigfachen Funktionen dieses Zelltyps ist die Umhüllung von Axonen im zentralen und peripheren Nervensystem (ZNS und PNS). Um eine vollständige Umhüllung zu gewährleisten, wandern Gliazellen während der Neurogenese zum Teil über enorme Distanzen von ihrem Entstehungsort aus. Dies trifft insbesondere auf die Gliazellen zu, durch deren Membranausläufer die distalen Axonbereiche der peripheren Nerven isoliert werden.rnIn dieser Arbeit wurde die Migration von Gliazellen anhand des Modelorganismus Drosophila untersucht. Ein besonderes Interesse galt dabei der Wanderung einer distinkten Population von Gliazellen, den sogenannten embryonalen Peripheren Gliazellen (ePG). Die ePGs werden überwiegend im sich entwickelnden ventralen Bauchmark geboren und wandern anschließend entlang der peripheren Nerventrakte nach dorsal aus, um diese bis zum Ende der Embryogenese zu umhüllen und dadurch die gliale Blut-Nerv-Schranke zu etablieren. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, neue Faktoren bzw. Mechanismen aufzudecken, durch welche die Migration der ePGs reguliert wird. Dazu wurde zunächst der wildtypische Verlauf ihrer Wanderung detailliert analysiert. Es stellte sich heraus, dass in jedem abdominalen Hemisegment eine invariante Anzahl von 12 ePGs von distinkten neuralen Vorläuferzellen generiert wird, die individuelle Identitäten besitzen und mittels molekularer Marker auf Einzelzellebene identifiziert werden können. Basierend auf der charakteristischen Lage der Zellen erfolgte die Etablierung einer neuen, konsistenten Nomenklatur für sämtliche ePGs. Darüber hinaus offenbarten in vivo Migrationsanalysen, dass die Wanderung individueller ePGs stereotyp verläuft und demzufolge weitestgehend prädeterminiert ist. Die genaue Kenntnis der wildtypischen ePG Migration auf Einzelzellebene diente anschließend als Grundlage für detaillierte Mutantenanalysen. Anhand derer konnte für den ebenfalls als molekularen Marker verwendeten Transkriptionsfaktor Castor eine Funktion als zellspezifische Determinante für die korrekte Spezifizierung der ePG6 und ePG8 nachgewiesen werden, dessen Verlust in einem signifikanten Migrationsdefekt dieser beiden ePGs resultiert. Des Weiteren konnte mit Netrin (NetB) der erste diffusible und richtungsweisende Faktor für die Migration von ePGs enthüllt werden, der in Interaktion mit dem Rezeptor Uncoordinated5 speziell die Wanderung der ePG6 und ePG8 leitet. Die von den übrigen Gliazellen unabhängige Navigation der ePG6 und ePG8 belegt, dass zumindest die Migration von Gruppen der ePGs durch unterschiedliche Mechanismen kontrolliert wird, was durch die Resultate der durchgeführten Ablationsexperimente bestätigt wird. rnFerner konnte gezeigt werden, dass während der frühen Gliogenese eine zuvor unbekannte, von Neuroblasten bereitgestellte Netrinquelle an der initialen Wegfindung der Longitudinalen Gliazellen (eine Population Neuropil-assoziierter Gliazellen im ZNS) beteiligt ist. In diesem Kontext erfolgt die Signaldetektion bereits in deren Vorläuferzelle, dem Longitudinalen Glioblasten, zellautonom über den Rezeptor Frazzled. rnFür künftige Mutantenscreens zur Identifizierung weiterer an der Migration der ePGs beteiligter Faktoren stellt die in dieser Arbeit präsentierte detaillierte Beschreibung eine wichtige Grundlage dar. Speziell in Kombination mit den vorgestellten molekularen Markern liefert sie die Voraussetzung dafür, individuelle ePGs auch im mutanten Hintergrund zu erfassen, wodurch selbst subtile Phänotypen überhaupt erst detektiert und auf Einzelzellebene analysiert werden können. Aufgrund der aufgezeigten voneinander unabhängigen Wegfindung, erscheinen Mutantenanalysen ohne derartige Möglichkeiten wenig erfolgversprechend, da Mutationen vermutlich mehrheitlich die Migration einzelner oder weniger ePGs beeinträchtigen. Letzten Endes wird somit die Aussicht verbessert, weitere neuartige Migrationsfaktoren im Modellorganismus Drosophila zu entschlüsseln, die gegebenenfalls bis hin zu höheren Organismen konserviert sind und folglich zum Verständnis der Gliazellwanderung in Vertebraten beitragen.