The NreABC system of Staphylococcus carnosus combines nitrate and oxygen sensing by an NreA,NreB sensor complex

Staphylococcus carnosus is a facultative anaerobic bacterium which features the cytoplasmic NreABC system. It is necessary for regulation of nitrate respiration and the nitrate reductase gene narG in response to oxygen and nitrate availability. NreB is a sensor kinase of a two-component system and represents the oxygen sensor of the system. It binds an oxygen labile [4Fe-4S]2+ cluster under anaerobic conditions. NreB autophosphorylates and phosphoryl transfer activates the response regulator NreC which induces narG expression. The third component of the Nre system is the nitrate receptor NreA. In this study the role of the nitrate receptor protein NreA in nitrate regulation and its functional and physiological effect on oxygen regulation and interaction with the NreBC two-component system were detected. In vivo, a reporter gene assay for measuring expression of the NreABC regulated nitrate reductase gene narG was used for quantitative evaluation of NreA function. Maximal narG expression in wild type S. carnosus required anaerobic conditions and the presence of nitrate. Deletion of nreA allowed expression of narG under aerobic conditions, and under anaerobic conditions nitrate was no longer required for maximal induction. This indicates that NreA is a nitrate regulated inhibitor of narG expression. Purified NreA and variant NreA(Y95A) inhibited the autophosphorylation of anaerobic NreB in part and completely, respectively. Neither NreA nor NreA(Y95A) stimulated dephosphorylation of NreB-phosphate, however. Inhibition of phosphorylation was relieved completely when NreA with bound nitrate (NreA•[NO3-]) was used. The same effects of NreA were monitored with aerobically isolated Fe-S-less NreB, which indicates that NreA does not have an influence on the iron-sulfur cluster of NreB. In summary, the data of this study show that NreA interacts with the oxygen sensor NreB and controls its phosphorylation level in a nitrate dependent manner. This modulation of NreB-function by NreA and nitrate results in nitrate/oxygen co-sensing by an NreA/NreB sensory unit. It transmits the regulatory signal from oxygen and nitrate in a joint signal to target promoters. Therefore, nitrate and oxygen regulation of nitrate dissimilation follows a new mode of regulation not present in other facultative anaerobic bacteria.

Entwicklung von chiralen- sowie RP-HPLC-Methoden in Verbindung mit hochauflösender MS und deren Anwendung zur Analyse sekundärer organischer Aerosole in der Atmosphäre

Die Erdatmosphäre besteht hauptsächlich aus Stickstoff (78%), Sauerstoff (21%) und Edelga¬sen. Obwohl Partikel weniger als 0,1% ausmachen, spielen sie eine entscheidende Rolle in der Chemie und Physik der Atmosphäre, da sie das Klima der Erde sowohl direkt als auch indirekt beeinflussen. Je nach Art der Bildung unterscheidet man zwischen primären und sekundären Partikeln, wobei primäre Partikel direkt in die Atmosphäre eingetragen werden. Sekundäre Partikel hingegen entstehen durch Kondensation von schwerflüchtigen Verbindungen aus der Gasphase, welche durch Reaktionen von gasförmigen Vorläufersubstanzen (volatile organic compounds, VOCs) mit atmosphärischen Oxidantien wie Ozon oder OH-Radikalen gebildet werden. Da die meisten Vorläufersubstanzen organischer Natur sind, wird das daraus gebil¬dete Aerosol als sekundäres organisches Aerosol (SOA) bezeichnet. Anders als die meisten primären Partikel stammen die VOCs überwiegend aus biogenen Quellen. Es handelt sich da¬bei um ungesättigte Kohlenwasserstoffe, die bei intensiver Sonneneinstrahlung und hohen Temperaturen von Pflanzen emittiert werden. Viele der leichtflüchtigen Vorläufersubstanzen sind chiral, sowohl die Vorläufer als auch die daraus gebildeten Partikel werden aber in den meisten Studien als eine Verbindung betrachtet und gemeinsam analysiert. Die mit Modellen berechneten SOA-Konzentrationen, welche auf dieser traditionellen Vorstellung der SOA-Bil¬dung beruhen, liegen deutlich unterhalb der in der Atmosphäre gefundenen, so dass neben diesem Bildungsweg auch noch andere SOA-Bildungsarten existieren müssen. Aus diesem Grund wird der Fokus der heutigen Forschung vermehrt auf die heterogene Chemie in der Partikelphase gerichtet. Glyoxal als Modellsubstanz kommt hierbei eine wichtige Rolle zu. Es handelt sich bei dieser Verbindung um ein Molekül mit einem hohen Dampfdruck, das auf Grund dieser Eigenschaft nur in der Gasphase zu finden sein sollte. Da es aber über zwei Alde¬hydgruppen verfügt, ist es sehr gut wasserlöslich und kann dadurch in die Partikelphase über¬gehen, wo es heterogenen chemischen Prozessen unterliegt. Unter anderem werden in An¬wesenheit von Ammoniumionen Imidazole gebildet, welche wegen der beiden Stickstoff-He¬teroatome lichtabsorbierende Eigenschaften besitzen. Die Verteilung von Glyoxal zwischen der Gas- und der Partikelphase wird durch das Henrysche Gesetz beschrieben, wobei die Gleichgewichtskonstante die sogenannte Henry-Konstante ist. Diese ist abhängig von der un¬tersuchten organischen Verbindung und den im Partikel vorhandenen anorganischen Salzen. Für die Untersuchung chiraler Verbindungen im SOA wurde zunächst eine Filterextraktions¬methode entwickelt und die erhaltenen Proben anschließend mittels chiraler Hochleistungs-Flüssigchromatographie, welche an ein Elektrospray-Massenspektrometer gekoppelt war, analysiert. Der Fokus lag hierbei auf dem am häufigsten emittierten Monoterpen α-Pinen und seinem Hauptprodukt, der Pinsäure. Da bei der Ozonolyse des α-Pinens das cyclische Grund¬gerüst erhalten bleibt, können trotz der beiden im Molekül vorhanden chiralen Zentren nur zwei Pinsäure Enantiomere gebildet werden. Als Extraktionsmittel wurde eine Mischung aus Methanol/Wasser 9/1 gewählt, mit welcher Extraktionseffizienzen von 65% für Pinsäure Enan¬tiomer 1 und 68% für Pinsäure Enantiomer 2 erreicht werden konnten. Des Weiteren wurden Experimente in einer Atmosphärensimulationskammer durchgeführt, um die Produkte der α-Pinen Ozonolyse eindeutig zu charakterisieren. Enantiomer 1 wurde demnach aus (+)-α-Pinen gebildet und Enantiomer 2 entstand aus (-)-α-Pinen. Auf Filterproben aus dem brasilianischen Regenwald konnte ausschließlich Pinsäure Enantiomer 2 gefunden werden. Enantiomer 1 lag dauerhaft unterhalb der Nachweisgrenze von 18,27 ng/mL. Im borealen Nadelwald war das Verhältnis umgekehrt und Pinsäure Enantiomer 1 überwog vor Pinsäure Enantiomer 2. Das Verhältnis betrug 56% Enantiomer 1 zu 44% Enantiomer 2. Saisonale Verläufe im tropischen Regenwald zeigten, dass die Konzentrationen zur Trockenzeit im August höher waren als wäh¬rend der Regenzeit im Februar. Auch im borealen Nadelwald wurden im Sommer höhere Kon¬zentrationen gemessen als im Winter. Die Verhältnisse der Enantiomere änderten sich nicht im jahreszeitlichen Verlauf. Die Bestimmung der Henry-Konstanten von Glyoxal bei verschiedenen Saataerosolen, nämlich Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Kaliumsulfat, Natriumchlorid und Ammoniumnitrat sowie die irreversible Produktbildung aus Glyoxal in Anwesenheit von Ammoniak waren Forschungs¬gegenstand einer Atmosphärensimulationskammer-Kampagne am Paul-Scherrer-Institut in Villigen, Schweiz. Hierzu wurde zunächst das zu untersuchende Saataerosol in der Kammer vorgelegt und dann aus photochemisch erzeugten OH-Radikalen und Acetylen Glyoxal er¬zeugt. Für die Bestimmung der Glyoxalkonzentration im Kammeraerosol wurde zunächst eine beste¬hende Filterextraktionsmethode modifiziert und die Analyse mittels hochauflösender Mas¬senspektrometrie realisiert. Als Extraktionsmittel kam 100% Acetonitril, ACN zum Einsatz wo¬bei die Extraktionseffizienz bei 85% lag. Für die anschließende Derivatisierung wurde 2,4-Di¬nitrophenylhydrazin, DNPH verwendet. Dieses musste zuvor drei Mal mittels Festphasenex¬traktion gereinigt werden um störende Blindwerte ausreichend zu minimieren. Die gefunde¬nen Henry-Konstanten für Ammoniumsulfat als Saataerosol stimmten gut mit in der Literatur gefundenen Werten überein. Die Werte für Natriumnitrat und Natriumchlorid als Saataerosol waren kleiner als die von Ammoniumsulfat aber größer als der Wert von reinem Wasser. Für Ammoniumnitrat und Kaliumsulfat konnten keine Konstanten berechnet werden. Alle drei Saataerosole führten zu einem „Salting-in“. Das bedeutet, dass bei Erhöhung der Salzmolalität auch die Glyoxalkonzentration im Partikel stieg. Diese Beobachtungen sind auch in der Litera¬tur beschrieben, wobei die Ergebnisse dort nicht auf der Durchführung von Kammerexperi¬menten beruhen, sondern mittels bulk-Experimenten generiert wurden. Für die Trennung der Imidazole wurde eine neue Filterextraktionsmethode entwickelt, wobei sich ein Gemisch aus mit HCl angesäuertem ACN/H2O im Verhältnis 9/1 als optimales Extrak¬tionsmittel herausstellte. Drei verschiedenen Imidazole konnten mit dieser Methode quanti¬fiziert werden, nämlich 1-H-Imidazol-4-carbaldehyd (IC), Imidazol (IM) und 2,2‘-Biimidazol (BI). Die Effizienzen lagen für BI bei 95%, für IC bei 58% und für IM bei 75%. Kammerexperimente unter Zugabe von Ammoniak zeigten höhere Imidazolkonzentrationen als solche ohne. Wurden die Experimente ohne Ammoniak in Anwesenheit von Ammoni¬umsulfat durchgeführt, wurden höhere Imidazol-Konzentrationen gefunden als ohne Ammo¬niumionen. Auch die relative Luftfeuchtigkeit spielte eine wichtige Rolle, da sowohl eine zu hohe als auch eine zu niedrige relative Luftfeuchtigkeit zu einer verminderten Imidazolbildung führte. Durch mit 13C-markiertem Kohlenstoff durchgeführte Experimente konnte eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei den gebildeten Imidazolen und Glyoxalprodukte handelte. Außerdem konnte der in der Literatur beschriebene Bildungsmechanismus erfolgreich weiter¬entwickelt werden. Während der CYPHEX Kampagne in Zypern konnten erstmalig Imidazole in Feldproben nach¬gewiesen werden. Das Hauptprodukt IC zeigte einen tageszeitlichen Verlauf mit höheren Kon¬zentrationen während der Nacht und korrelierte signifikant aber schwach mit der Acidität und Ammoniumionenkonzentration des gefundenen Aerosols.

The role of DNA damage in the pathogenesis of nitrate tolerance - nitrosative versus oxidative DNA damage

6. Summary Despite the lack of direct evidence from large clinical trials for mutagenic and genotoxic effects of GTN therapy, the present study show s the induction of pre-mutagenic lesions, such as 8- oxo - G and O 6 - me - G by GTN t reatment as well as increased formation of DNA strand breaks. These results were obtained in an in vitro (EA.hy 926 – human endothelial cell line) and in vivo (Wistar rats and C57BL/6 mice) setting. However, GTN - induced DNA damage had no effect on the degr ee of nitrate tolerance but only on other pathological side effects such as oxidative stress, as confirmed by studies in MGMT knockout mice. Of clinical importance , this study establishes potent apoptotic properties of organic nitrates, which has been demo nstrated by the levels of the novel apoptotic marker and caspase - 3 substrate, fractin, as well as levels of cleaved caspase - 3 , the activated form of this pro - apoptotic enzyme . The p rotein analy tical data ha ve been confirmed by an independent assay for the apoptosis , Cell death detection assay (TUNEL) . First, these GTN - mediated apoptotic effects may account for the previously reported anti - cancer effects of GTN therapy (probably based on induction of apoptosis in tumor cells). Second, these GTN - mediated apop totic effects may account for the increased mortality rates observed in the group of organic nitrate - treated patients as reported by two independent meta - analysis (probably due to induction of apoptosis in highly beneficial endothelial progenitor cells as well as in cardiomyocytes during wound healing and cardiac remodeling) . Summary of the current investigations can be seen in Figure 18.