The NreABC system of Staphylococcus carnosus combines nitrate and oxygen sensing by an NreA,NreB sensor complex

Staphylococcus carnosus is a facultative anaerobic bacterium which features the cytoplasmic NreABC system. It is necessary for regulation of nitrate respiration and the nitrate reductase gene narG in response to oxygen and nitrate availability. NreB is a sensor kinase of a two-component system and represents the oxygen sensor of the system. It binds an oxygen labile [4Fe-4S]2+ cluster under anaerobic conditions. NreB autophosphorylates and phosphoryl transfer activates the response regulator NreC which induces narG expression. The third component of the Nre system is the nitrate receptor NreA. In this study the role of the nitrate receptor protein NreA in nitrate regulation and its functional and physiological effect on oxygen regulation and interaction with the NreBC two-component system were detected. In vivo, a reporter gene assay for measuring expression of the NreABC regulated nitrate reductase gene narG was used for quantitative evaluation of NreA function. Maximal narG expression in wild type S. carnosus required anaerobic conditions and the presence of nitrate. Deletion of nreA allowed expression of narG under aerobic conditions, and under anaerobic conditions nitrate was no longer required for maximal induction. This indicates that NreA is a nitrate regulated inhibitor of narG expression. Purified NreA and variant NreA(Y95A) inhibited the autophosphorylation of anaerobic NreB in part and completely, respectively. Neither NreA nor NreA(Y95A) stimulated dephosphorylation of NreB-phosphate, however. Inhibition of phosphorylation was relieved completely when NreA with bound nitrate (NreA•[NO3-]) was used. The same effects of NreA were monitored with aerobically isolated Fe-S-less NreB, which indicates that NreA does not have an influence on the iron-sulfur cluster of NreB. In summary, the data of this study show that NreA interacts with the oxygen sensor NreB and controls its phosphorylation level in a nitrate dependent manner. This modulation of NreB-function by NreA and nitrate results in nitrate/oxygen co-sensing by an NreA/NreB sensory unit. It transmits the regulatory signal from oxygen and nitrate in a joint signal to target promoters. Therefore, nitrate and oxygen regulation of nitrate dissimilation follows a new mode of regulation not present in other facultative anaerobic bacteria.

The oxygen sensors FNR from Escherichia coli and NreABC from Staphylococcus carnosus

Im Laufe der Evolution entwickelte sich eine Reihe von Sauerstoff-Sensorsystemen in Bakterien, um die Genexpression der Sauerstoffverfügbarkeit anzupassen. Der Sauerstoffsensor FNR aus Escherichia coli bindet unter anaeroben Bedingungen ein [4Fe4S]2+ Zentrum. Unter Sauerstoffeinfluß zerfällt aktives [4Fe4S]2+FNR zu inaktivem [2Fe2S]2+FNR und weiter zu ebenfalls inaktivem apoFNR. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zustand von FNR in vivo in aeroben und anaeroben Zellen von Escherichia coli aufgeklärt. Durch Alkylierung der Cysteine in FNR und anschließender Analyse im Massenspektrometer konnte gezeigt werden, das FNR in aeroben Zellen hauptsächlich in der apo-Form vorliegt. Nach ca. 6 Minuten war in lebenden E. coli Zellen die Umwandlung von [4Fe4S]2+ FNR zu apoFNR abgeschlossen.rnrnIn dem gram positiven Bakterium Staphylococcus carnosus aktiviert das NreBC System unter anaeroben Wachstumsbedingungen die Gene der Nitratatmung. NreB ist eine cytoplasmatische Sensorhistidinkinase, die ein sauerstofflabiles [4Fe4S]2+ Zentrum über eine PAS-Domäne bindet. Das [4Fe4S]2+ Zentrum wird von vier Cysteinen gebunden. Der Responsregulator NreC steuert nach Aktivierung durch NreB die Transkription der Zielgene. In der vorliegenden Arbeit wurde NreB mit Hilfe von Cysteinmarkierungen in vivo charakterisiert. Durch die Änderung der Cystein-Zugänglichkeit für Thiolreagenzien nach Sauerstoffzugabe konnte eine Halbwertszeit von ca. 3 Minuten für das [4Fe4S]2+ Zentrum in vivo bestimmt werden. In anaeroben Bakterien stellt [4Fe4S]2+NreB die Hauptform von NreB dar, während in aeroben Bakterien hauptsächlich apoNreB vorkommt. Dieses Ergebnis konnte durch Massenspektroskopie bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden das NreA mit NreB und NreC wechselwirkt und Bestandteil des NreABC Drei-Komponentensystems ist. rn

Aktivierung des Sauerstoffsensors FNR von Escherichia coli durch Glutathion in vivo und in vitro

Der Sauerstoffsensor FNR (Fumarat-Nitratreduktase-Regulator) von Escherichia coli spielt eine wichtige Rolle beim Umschalten vom aeroben zum anaeroben Stoffwechsel. FNR ist ein Transkriptionsregulator, der im aktiven Zustand ein [4Fe4S]-Zentrum besitzt. Bei Kontakt mit Sauerstoff zerfällt das [4Fe4S]- zu einem [2Fe2S]-Zentrum und führt zum Verlust der Aktivität von FNR. Die Reaktionen, die zum Aufbau des [4Fe4S]-Zentrums und der reduktiven Aktivierung von aerob und anaerob isoliertem apoFNR führen, wurden in vivo und in vitro untersucht. Die Einfluß in vivo von Glutathion auf die Funktion von FNR und die Rolle von Glutathion beim Aufbau des [4Fe4S]-Zentrums in gereinigtem apoFNR zeigen die wichtige Bedeutung von Glutathion bei der de novo Assemblierung von [4Fe4S]FNR und bei der reduktiven Aktivierung von sauerstoff-inaktiviertem FNR. Die energetischen Parameter von E. coli und ihre Änderungen beim Übergang vom aeroben zum anaeroben Stoffwechsel wurden untersucht. Das elektrochemische Protonenpotential delta-p über der Cytoplasmamembran wurde im Gleichgewichtszustand in der aeroben Atmung und anaeroben Nitrat-, Fumarat- und Dimethylsulfoxid-Atmung bestimmt. Delta-p betrug in der aeroben Atmung -160 mV, in der anaeroben Atmung sank delta-p entgegen früheren Vermutungen lediglich um 20 mV. Die geringen Änderungen von delta-p können deshalb vermutlich nicht als regulatorisches Signal für das Umschalten vom aeroben zum anaeroben Stoffwechsel genutzt werden.

Untersuchungen zur Expression und Funktion intrazellulärer Globine

Im Rahmen meiner Dissertation untersuchte ich die intrazelluläre Lokalisation des Hämoglobin von Drosophila melanogaster, sowie von Neuroglobin und Cytoglobin der Vertebraten. Obwohl alle drei Globine erst kürzlich entdeckt wurden, liegen bereits Daten über ihre Struktur, ihre biochemischen Eigenschaften und die Lokalisation der mRNA vor. Ihre Funktionen konnten bisher jedoch nicht eindeutig geklärt werden. Das Globin von Drosophila melanogaster konnte mittels Westernblot sowohl in Larven als auch adulten Fliegen nachgewiesen werden. Ebenso war es mir möglich, mittels Immunperoxidaseuntersuchungen die Tracheen, die Terminalzellen der Tracheolen sowie die Fettkörperzellen als Ort der Globinexpression in Drosophila zu identifizieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass dieses Globin eine Funktion als Sauerstoffpuffer, der sowohl Sauerstoff speichert als auch transportiert, hin. Damit würde das Drosophila Globin eine zu anderen Insektenglobinen vergleichbare Funktion übernehmen. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass Neuroglobin auch in der neuronalen Netzhaut von Säugern und Fischen vorkommt. Des Weiteren konnte Neuroglobin in der Retina zellulär sowie subzellulär lokalisiert werden. In der avaskulären Mäuseretina wurde Neuroglobin neben den Innensegmenten der Photorezeptorzellen, auch noch in den beiden plexiformen Schichten sowie in der Ganglienzellschicht gefunden. Die gezeigte Kolokalisation dieses intrazellulären Globins mit Mitochondrien und somit auch mit den Orten des höchsten Sauerstoffbedarfs in der Retina deutet auf eine Funktion im Sauerstofftransport zu den Mitochondrien hin. Des Weiteren könnte Neuroglobin auch als Sauerstoffspeicher dienen, der es Neuronen ermöglicht, kurzfristige hypoxische Bedingungen unbeschadet zu überstehen. Andere mögliche Funktionen wie z.B. die als Detoxifizierer von reaktiven Sauerstoff- bzw. Sickstoffverbindungen, als Sauerstoffsensor, sowie als terminale Oxidase erscheinen durch die gezeigten Daten eher unwahrscheinlich. Die bisherige Annahme, dass Cytoglobin ein ubiquitär exprimiertes Protein ist, konnte von mir nicht bestätigt werden. Für nichtneuronale Gewebe konnte gezeigt werden, dass Cytoglobin lediglich auf das Cytoplasma von Fibroblasten und ontogenetisch verwandte Zelltypen wie Osteoblasten, Chondroblasten und Sternzellen beschränkt ist. Möglicherweise hat Cytoglobin dort eine Funktion in der Kollagensynthese. Ferner wird Cygb cytoplasmatisch und nukleär in einigen Neuronen der Retina und des Gehirns exprimiert. Dort könnte Cygb z.B. nukleäre Enzyme wie die NO-Synthase mit Sauerstoff versorgen. Andere Funktionen scheinen aufgrund meiner Daten im Moment unwahrscheinlich.

Charakterisierung von apoFNR, einer weiteren Form des Sauerstoffsensors FNR aus Escherichia coli und von NreB, einem potentiellen Sauerstoffsensor aus Staphylococcus carnosus

FNR (Fumarat Nitratreduktase Regulator) ist der Sauerstoffsensor aus Escherichia coli. Bisher waren zwei Formen von FNR bekannt, der aktive Zustand, ein Dimer mit je einem [4Fe4S]-Zentrum und ein inaktiver Zustand, in dem FNR als Monomer mit je einem [2Fe2S]-Zentrum vorliegt. Die Untersuchungen dieser Arbeit geben nun Hinweise, dass es mit apoFNR eine dritte physiologische Form von FNR gibt. Es wurde die Entstehung von apoFNR aus [4Fe4S]•FNR untersucht und die biochemischen Eigenschaften von apoFNR charakterisiert. ApoFNR konnte in vitro zu [4Fe4S]•FNR rekonstituiert werden, hierbei konnte die Lagphase der Rekonstitution durch Zusatz von Glutaredoxinen zum Rekonstitutionsansatz verkürzt werden. FNR, dessen Cysteinreste in vivo unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen mit 4-Acetamido-4´-Maleimidylstilbene-2,2´Disulfonsäure markiert wurden, zeigt auf SDS-Gelen einen Shift zu einer höheren Masse im Vergleich zu unmarkiertem FNR. Allerdings trat in aeroben Zellen eine zusätzliche Bande bei einer niedrigeren Masse auf. Es waren hier also weniger Cysteinreste markierbar. Weiterhin wurde mit NreB ein potentieller Sauerstoffsensor aus Staphylococcus carnosus untersucht. Es wurden Hinweise auf ein Eisen-Schwefel-Zentrum vom FNR-Typ als Cofaktor gefunden. Der Einbau dieses Cofaktors war abhängig von der Anwesenheit der Cysteinreste in NreB, von der Cysteindesulfurase NifSAV und von Eisenionen. Der Cofaktor war sauerstoffempfindlich und beeinflusste die Autophosphorylierung von NreB.