The characterization of the Atxn2-CAG42-knock-in mouse as a model for Spinocerebellar Ataxia Type 2

Die Ursache der neurodegenerativen Erkrankung Spinozerebelläre Ataxie Typ 2 (SCA2) ist eine expandierte Polyglutamin-Domäne im humanen ATXN2-Gen von normalerweise 22 auf über 31 CAGs. Von der Degeneration sind vorwiegend die zerebellären Purkinje Neuronen betroffen, in denen zunehmend zytoplasmatische Aggregate sichtbar werden. Auch wenn die genaue Funktion von ATXN2 und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen noch immer ungeklärt sind, werden ein toxischer Funktionsgewinn sowie der Verlust der normalen Proteinfunktion als mögliche Ursachen diskutiert.rnUm ein wirklichkeitsgetreues Tiermodell für die SCA2 zu haben, wurde eine knock-in Maus generiert, deren einzelnes CAG im Atxn2-Gen durch 42 CAGs ersetzt wurde. Dieses Mausmodell ist durch eine stabile Vererbung der Expansion charakterisiert. Weiterhin zeigt sie ein verringertes Körpergewicht sowie eine spät beginnende motorische Inkoordination, was dem Krankheitsbild von SCA2 entspricht. rnIm Weiteren konnte gezeigt werden, dass, obwohl die Atxn2 mRNA-Spiegel in Großhirn und Kleinhirn erhöht waren, die Menge an löslichem ATXN2 im Laufe der Zeit abnahm und dies mit einem Auftreten an unlöslichem ATXN2 korrelierte. Dieser im Kleinhirn progressive Prozess resultierte schließlich in zytoplasmatischen Aggregaten innerhalb der Purkinje Neuronen alter Mäuse. Der Verlust an löslichem ATXN2 könnte Effekte erklären, die auf einen partiellen Funktionsverlust von ATXN2 zurückzuführen sind, wobei die Aggregatbildung einen toxischen Funktionsgewinn wiederspiegeln könnte. Neben ATXN2 wurde auch sein Interaktor PABPC1 zunehmend unlöslich. Während dies im Großhirn eine Erhöhung der PABPC1 mRNA- und löslichen Proteinspiegel zur Folge hatte, konnte keine kompensatorische Veränderung seiner mRNA und zudem eine Verminderung an löslichem PABPC1 im Kleinhirn beobachtet werden. Auch PABPC1 wurde in Aggregate sequestriert. Diese Unterschiede zwischen Großhirn und Kleinhirn könnten zu der spezifischen Vulnerabilität des Kleinhirns beitragen.rnUm die Folgen auf mRNA-Prozessierung zu untersuchen, wurde ein Transkriptomprofil im mittleren sowie fortgeschrittenen Alter der Mäuse erstellt. Hierbei war eine erhöhte Expression von Fbxw8 im Kleinhirn alter Mäuse auffällig. Als Komponente eines Ubiquitin-E3-Ligase-Komplexes, hilft FBXW8 in der Degradierung von Zielproteinen und könnte somit die Toxizität des expandieren ATXN2 verringern. rnZur näheren Beschreibung der physiologischen Funktion von ATXN2, konnte in ATXN2-knock-out Mäusen gezeigt werden, dass das Fehlen von ATXN2 zu einer reduzierten globalen Proteinsyntheserate führte und somit eine Rolle als Translationsaktivator möglich erscheint. Kompensatorisch wurde eine erhöhte S6-Phosphorylierung gemessen.

Gene therapy for a novel mouse model of Canavan disease

Canavan disease (CD) is a rare leukodystrophy caused by loss-of-function mutations in the gene encoding aspartoacylase (ASPA), an oligodendrocyte-enriched enzyme. It is characterised by the accumulation of the ASPA substrate N-acetylaspartate (NAA) in brain, blood and urine, leading to a spongiform vacuolisation of the brain, severe motoric and cognitive impairments and premature death. To date, no therapy is available due to the lack of a gene-transfer system allowing transgene expression in oligodendrocytes (OLs) and the restoration of the missing enzyme. Hence, the aim of this study was to establish a novel gene-transfer system and its preclinical evaluation in a CD animal model.rnIn the first part of this thesis, a novel ASPA mouse mutant was generated. A βgeo cassette (including the genes encoding β-galactosidase and neomycin) flanked by frt sites was inserted into intron 1 of the intact aspa gene. Additionally, exon 2 was flanked by loxP sites for optional conditional deletion of the targeted locus. The resulting ASPA-deficient aspalacZ/lacZ-mouse was found to be an accurate model of CD and an important tool to identify novel aspects of its complex pathology. Homozygous mutants showed a CD-like histopathology, neurological impairment, behavioural deficits as well as a reduced body weight. Additionally, MRI data revealed changes in brain metabolite composition. rnRecombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors have become a versatile tool for gene transfer to the central nervous system because they are efficient, non-toxic and replication-deficient. Based on the natural neurotropism of AAV vectors, AAV-based gene delivery has entered the clinics for the treatment of neurodegenerative diseases. However, the lack of AAV vectors with oligodendroglial tropism has precluded gene therapy for leukodystrophies. In the second part of this work, it was shown that the transduction profile of established AAV serotypes can be targeted towards OLs in a transcriptional approach, using the oligodendrocyte-specific myelin basic protein (MBP) promoter to drive transgene expression in OLs.rnIn the last part of this work, the therapeutic efficacy of AAV-mediated aspa gene transfer to OLs of juvenile aspalacZ/lacZ mice was evaluated. AAV-aspa injections into multiple sites of the brain parenchyma resulted in transduction of OLs in the grey and white matter throughout the brain. Histological abnormalities in the brain of ASPA-deficient mice were ameliorated and accompanied by a reduction of NAA levels. Furthermore, the treatment resulted in normalisation of body weight, motor function and nest-building behaviour. These data provide a proof-of-concept for a successful gene therapy of Canavan disease. This might pave the way towards translation into clinical application and serve as the basis for the genetic treatment of other leukodystrophies.