Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse model

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse modelrnRaja Vuyyuru and Wulf O. BöcherrnHepatitis B is a liver disease caused by Hepatitis B virus (HBV). It ranges in severity from a mild illness, lasting a few weeks (acute), to a serious long-term (chronic) illness that can lead either to liver disease or liver cancer. Acute infection is self limiting in most adults, resulting in clearance of virus from blood and liver and the development of lasting immunity. However 5% of acutely infected patients do not resolve primary HBV infection, leading to chronic infection with persistent viral replication in the liver. The strength of the initial antiviral immune response elicited to Hepatitis B determines the subsequent clinical outcome. A strong and broad T cell response leads to spontaneous resolution. Conversely, a weak T cell response favours viral persistence and establishment of chronic disease. While treatments using interferon-alpha or nucleos(t)ide analogues can reduce disease progression, they rarely lead to complete recovery. The lack of a suitable small animal model hampered efforts to understand the mechanisms responsible for immune failure in these chronic patients.rnIn current study we used Trimera mice to study the efficacy of potential vaccine candidates using HBV loaded dendritic cells in HBV chronic infection in vivo. The Trimera mouse model is based on Balb/c mice implanted with SCID mouse bone marrow and human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HBV patients, and thus contains the immune system of the donor including their HBV associated T cell defect.rnIn our present study, strong HBV specific CD4+ and CD8+ T cell responses were enhanced by therapeutic vaccination in chronic HBV patients. These T cell responses occurred independently of either the course of the disease or the strength of their underlying HBV specific T cell failure. These findings indicate that the Trimera mouse model represents a novel experimental tool for evaluating potential anti-HBV immunotherapeutic agents. This in vivo data indicated that both the HBV specific CD4+ cell and CD8+ responses were elicited in the periphery. These HBV specific T cells proliferated and secreted cytokines upon restimulation in Trimera mice. The observation that these HBV specific T cells are not detectable directly ex vivo indicates that they must be immune tolerant or present at a very low frequency in situ. HBV specific T cell responses were suppressed in Trimera mice under viremic conditions, suggesting that viral factors might be directly involved in tolerizing or silencing antiviral T cell responses. Thus, combination of an effective vaccine with antiviral treatment to reduce viremia might be a more effective therapeutic strategy for the future. Such approaches should be tested in Trimera mice generated in HBV or HBs expressing transgenic mice before conducting clinical trials.rn

Leben mit Phenprocoumon — optimal versorgt? : Untersuchung der Qualität und Effektivität der Phenprocoumon-Therapie im ambulanten Sektor

In Deutschland wird zur oralen Vitamin-K-Antagonistentherapie überwiegend der Wirkstoff Phenprocoumon (PPC) eingesetzt und die meisten Patienten werden durch ihren Hausarzt betreut. In einer deskriptiven, nicht-interventionellen Studie wurde die Ist-Situation der Versorgung von PPC-Patienten im ambulanten Sektor untersucht. Ziel war es, die Qualität und Effektivität der bisherigen Standardtherapie zu evaluieren. In Anbetracht der Einführung der neuen oralen Antikoagulantien (NOAC) ist die Untersuchung der PPC-Therapie von besonderem Interesse. Dem „Throughput-Modell“ folgend sollten „Input“- und „Outcome“-Parameter analysiert werden. rnIn einer klinischen Studie wurden 50 ambulant behandelte Patienten mit PPC-Therapie jeweils über einen Zeitraum von 3 Jahren retrospektiv beobachtet. In 5 niedergelassenen Arztpraxen in Rheinland-Pfalz wurden dazu 10 Patienten pro Praxis rekrutiert. Anhand der Patientenakte wurde eine Dokumentenanalyse durchgeführt. Die Selbstmedikation wurde mit einem eigens erstellten Fragebogen erfasst. rnIm Studienkollektiv wurden im Median 3 Comorbiditäten ermittelt. Die mediane Wochendosis betrug 4,0 Tabletten à 3 mg PPC. Die Patienten wurden im Median mit weiteren 15 verschiedenen Wirkstoffen therapiert, einer davon wurde in Selbstmedikation eingenommen. Im gesamten Beobachtungszeitraum fanden pro Patient im Median 57 Arztbesuche statt, die durch die Phenprocoumon-Therapie bedingt waren. INR (International normalized ratio)-Messungen (Median 47) waren der häufigste Grund für die Arztbesuche, so dass ein 3-Wochen-Rhythmus vom Gesamtkollektiv zu 97% erreicht wurde. Die „stabile“ INR-Einstellung wurde im Median nach 94 Tagen erreicht. Die prozentuale Rate (INR (%)) für die Einhaltung des INR-Zielbereiches (ZSB) erreichte internationale Benchmark-Werte, was auf eine gute Versorgungsqualität hindeutete. Die genauere Analyse ergab jedoch große interindividuelle Schwankungen. Während der „stabilen“ INR-Einstellung wurden bessere Ergebnisse als im Gesamtbeobachtungszeitraum erzielt. Drei Patienten (6%) erreichten die „stabile“ INR-Einstellung innerhalb von 3 Jahren nie. Die Auswertung für den erweiterten ZSB (ZSB ± 0,2) ergab bessere INR (%)-Ergebnisse als für den ZSB. Die Zeit im INR-ZSB (TTR (%)) erreichte mit 75% höhere Werte als INR (%) im ZSB mit 70%. Tendenziell war das Patientenkollektiv eher unter- als übertherapiert (Median „Under-INR“ 18% bzw. „Over-INR“ 8%). Erkrankungen und Impfungen stellten die wichtigsten der zahlreichen Einflussfaktoren für INR-Shifts hin zu Werten außerhalb des ZSB dar. Patienten, die Comedikation mit hohem Interaktionspotential einnahmen, erreichten in den INR-Qualitätsindikatoren schlechtere Ergebnisse als Patienten ohne potentiell interagierende Comedikation (Mann-Whitney-U-Test; p-Wert=0,003 für TTR (%), p=0,008 für INR (%)). In Zeitintervallen der „stabilen“ INR-Einstellung war der Unterschied nur für TTR (%) auffällig (Mann-Whitney-U-Test; p=0,015). Für den erweiterten ZSB waren die Unterschiede bezüglich beider INR-Qualitätsindikatoren nicht auffällig. Insgesamt wurden 41 unerwünschte Ereignisse (UAW) beobachtet, davon 24 (59%) in der Phase der „stabilen“ INR-Einstellung (21 leichte Blutungen, 1 schwere Blutung, 2 thromboembolische Ereignisse (TE)). Je 4 leichte Blutungen (19%) wurden in einen möglichen bzw. sicheren kausalen Zusammenhang mit der VKA-Therapie gebracht, wenn ein Zeitintervall von 3 Tagen zwischen der INR-Messung und Auftreten der UAW geprüft wurde. Ein TE wurde als sicher kausal gewertet. Von insgesamt 5 Krankenhausaufenthalten waren 3 bzw. 2 durch Blutungen bzw. TE veranlasst. Des Weiteren wurde im 3-Tage-Zeitintervall für 4 INR-Shifts hin zu Werten außerhalb des ZSB eine Interaktion mit verordneter CM als in sicherem oder möglichem kausalen Zusammenhang bewertet. Bei 49% der beobachteten Grippeimpfungen wurde ein INR-Shift festgestellt, der in ca. 60% der Fälle zu einem subtherapeutischen INR-Wert führte. Insgesamt war das klinische Ergebnis nicht optimal. rnDas „Outcome“ in Form der gesundheitsbezogenen Lebensqualität (LQ) wurde retrospektiv-prospektiv mittels SF-36-Fragebogen ermittelt. Die Patienten zeigten gegenüber der Normalbevölkerung einen Verlust an LQ auf körperlicher Ebene bzw. einen Gewinn auf psychischer Ebene. Das humanistische Ergebnis erfüllte bzw. übertraf damit die Erwartungen. rnInsgesamt wiesen die Ergebnisse darauf hin, dass Qualität und Effektivität der Antikoagulationstherapie mit PPC im ambulanten Sektor weiterer Optimierung bedürfen. Mit intensivierten Betreuungsmodellen lässt sich ein besseres Outcome erzielen. rn

Molekulare Reaktionsmuster in dendritischen Zellen nach Allergenexposition

Allergische Erkrankungen, wie zum Beispiel die allergische Rhinitis oder das allergische Asthma haben im Verlauf der letzten vier Jahrzehnte stark zugenommen. So leidet heute jeder vierte bis fünfte Mensch an einer Allergie. Ausgelöst wird diese IgE-vermittelte Hypersensibilitätsreaktion des Typs I (Allergie vom Soforttyp) von Allergenen und beruht auf der Aktivierung von Mastzellen durch die Interaktion eines Antigens mit dem an eine Mastzelle über die Fc-Rezeptoren gebundenen IgE-Moleküls. Die degranulierende Mastzelle sezerniert Mediatoren, was zu einem Auftreten von allergischen Symptomen führt. Die Bildung von IgE wird durch das von TH2-Zellen produzierte Zytokin IL-4 induziert. Das von TH1-Zellen produzierte Zytokin IFN- ist in der Lage die Sekretion von IL-4 zu inhibieren, wie auch IL-4 hemmend auf die Produktion von IFN- wirkt. Dieses TH1-/ TH2-Gleichgewicht ist bei allergischen Erkrankungen in Richtung TH2 verschoben. Allergene werden von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und auf der Zelloberfläche präsentiert. Die potentesten antigenpräsentierenden Zellen sind die dendritischen Zellen, die nach Kontakt mit einem Allergen in die benachbarten Lymphknoten wandern, ausreifen und kostimulatorische Moleküle exprimieren. Sie sind so in der Lage T-Zellen zu aktivieren und entweder in TH1- oder in TH2-Zellen differenzieren zu lassen. Die zytokinabhängige TH1- beziehungsweise TH2-Differenzierung führt zur Aktivierung der Januskinasen. Im aktiven Zustand phosphorylieren sie STAT-Moleküle, die dimerisieren und in den Zellkern translozieren, wo sie unter anderem als Transkriptionsfaktoren für Zytokingene dienen. Unreife humane dendritische Zellen von Allergikern zeigen nach Stimulation mit Proteinallergenen eine schnelle Phosphorylierung des mit der TH2-Entwicklung assoziierten STAT6. Dahingegen sind TH1-Antwort hervorrufende Kontaktallergene nicht in der Lage STAT6 oder andere STAT-Moleküle in dendritischen Zellen zu induzieren. Die Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA3 sind ebenfalls von Bedeutung für die TH1-/TH2-Entwicklung, da T-bet ausschließlich in TH1-Zellen, GATA3 nur in TH2-Zellen exprimiert wird. Die Regulation des JAK/STAT-Weg unterliegt den Molekülen der intrazellulär vorkommenden Familie der SOCS-Proteine. SOCS3 ist in TH2-Zellen höher exprimiert als SOCS1, wohingegen SOCS1 in TH1-Zellen eine erhöhte Expression gegenüber SOCS3 aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Proteinallergenen auf humane dendritische Zellen untersucht. Zunächst konnte eine morphologische Veränderung der unreifen dendritischen Zellen nach Kontakt mit dem Allergenextrakt beobachtet werden. Die beginnende Ausreifung der Zellen konnte mittels Durchflußzytometrie anhand der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, insbesondere aber über den Marker für reife dendritische Zellen CD83, nachgewiesen werden. Die zu beobachtende beginnende Ausreifung scheint ein Effekt des bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) zu sein, das in dem Allergenextrakt vorkommt, da sich durch Zugabe des kationischen Antibiotikums Polymyxin B die beginnende Reifung verhindern ließ. Auf RNA-Ebene war es im Rahmen dieser Arbeit möglich, den Einfluss verschiedener Allergene auf unreifen humanen dendritischen Zellen näher zu charakterisieren. So weisen unreife humane dendritische Zellen nach Kontakt mit Proteinallergenextrakt ein TH2-assoziiertes Genexpressionprofil auf, was sich durch eine erhöhte relative Expression der Gene SOCS3 und GATA3 auszeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigen unreife humane dendritische Zellen nach Inkubation mit dem Kontaktallergen MCI/MI eine erhöhte relative Expression des Gens T-bet, was mit einer TH1-Antwort assoziiert ist. Nach Zugabe des „TH1-/ TH2-neutralen“ Tetanustoxoids konnten erhöhte relative Expressionen der Gene GATA3, T-bet und SOCS3 gemessen werden. Die Ergebnisse in dem in dieser Arbeit benutzten humanen in vitro System geben Anlass zur Hypothese, dass die Art der Immunantwort (TH1 versus TH2) sich bereits auf Ebene der dendritischen Zellen anbahnt. GeneChip-Analysen mittels High Density Micro Arrays von unreifen humanen dendritischen Zellen, die entweder mit Proteinallergenextrakt oder mit LPS in Berührung kamen, zeigten statistisch signifikant regulierte Gene, die allerdings keine Gemeinsamkeiten aufwiesen. Es konnten für die mit Alllergenextrakt gepulsten dendritischen Zellen insgesamt 10 Gene identifiziert werden, jedoch gelang es nicht, diese näher zu deuten oder in einen Zusammenhang mit der allergischen Erkrankung oder der dendritischen Zelle zu bringen. Für die mit LPS, dem stärkeren Stimulus, gepulsten dendritischen Zellen konnten 40 Gene identifiziert werden, die unter anderem für die Maturierung der dendritischen Zelle verantwortlich sind. Zudem war es möglich, die Daten der Arrays auf Proteinebene exemplarisch anhand des Chemokins CXCL2 (Gro-β) zu verifizieren.

Comparative DNA sequence and methylation analyses of orthologous genes in humans and non-human primates: Genetic and epigenetic footprints of evolution

Welche genetische Unterschiede machen uns verschieden von unseren nächsten Verwandten, den Schimpansen, und andererseits so ähnlich zu den Schimpansen? Was wir untersuchen und auch verstehen wollen, ist die komplexe Beziehung zwischen den multiplen genetischen und epigenetischen Unterschieden, deren Interaktion mit diversen Umwelt- und Kulturfaktoren in den beobachteten phänotypischen Unterschieden resultieren. Um aufzuklären, ob chromosomale Rearrangements zur Divergenz zwischen Mensch und Schimpanse beigetragen haben und welche selektiven Kräfte ihre Evolution geprägt haben, habe ich die kodierenden Sequenzen von 2 Mb umfassenden, die perizentrischen Inversionsbruchpunkte flankierenden Regionen auf den Chromosomen 1, 4, 5, 9, 12, 17 und 18 untersucht. Als Kontrolle dienten dabei 4 Mb umfassende kollineare Regionen auf den rearrangierten Chromosomen, welche mindestens 10 Mb von den Bruchpunktregionen entfernt lagen. Dabei konnte ich in den Bruchpunkten flankierenden Regionen im Vergleich zu den Kontrollregionen keine höhere Proteinevolutionsrate feststellen. Meine Ergebnisse unterstützen nicht die chromosomale Speziationshypothese für Mensch und Schimpanse, da der Anteil der positiv selektierten Gene (5,1% in den Bruchpunkten flankierenden Regionen und 7% in den Kontrollregionen) in beiden Regionen ähnlich war. Durch den Vergleich der Anzahl der positiv und negativ selektierten Gene per Chromosom konnte ich feststellen, dass Chromosom 9 die meisten und Chromosom 5 die wenigsten positiv selektierten Gene in den Bruchpunkt flankierenden Regionen und Kontrollregionen enthalten. Die Anzahl der negativ selektierten Gene (68) war dabei viel höher als die Anzahl der positiv selektierten Gene (17). Eine bioinformatische Analyse von publizierten Microarray-Expressionsdaten (Affymetrix Chip U95 und U133v2) ergab 31 Gene, die zwischen Mensch und Schimpanse differentiell exprimiert sind. Durch Untersuchung des dN/dS-Verhältnisses dieser 31 Gene konnte ich 7 Gene als negativ selektiert und nur 1 Gen als positiv selektiert identifizieren. Dieser Befund steht im Einklang mit dem Konzept, dass Genexpressionslevel unter stabilisierender Selektion evolvieren. Die meisten positiv selektierten Gene spielen überdies eine Rolle bei der Fortpflanzung. Viele dieser Speziesunterschiede resultieren eher aus Änderungen in der Genregulation als aus strukturellen Änderungen der Genprodukte. Man nimmt an, dass die meisten Unterschiede in der Genregulation sich auf transkriptioneller Ebene manifestieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen Mensch und Schimpanse untersucht. Dazu wurden die Methylierungsmuster der Promotor-CpG-Inseln von 12 Genen im Cortex von Menschen und Schimpansen mittels klassischer Bisulfit-Sequenzierung und Bisulfit-Pyrosequenzierung analysiert. Die Kandidatengene wurden wegen ihrer differentiellen Expressionsmuster zwischen Mensch und Schimpanse sowie wegen Ihrer Assoziation mit menschlichen Krankheiten oder dem genomischen Imprinting ausgewählt. Mit Ausnahme einiger individueller Positionen zeigte die Mehrzahl der analysierten Gene keine hohe intra- oder interspezifische Variation der DNA-Methylierung zwischen den beiden Spezies. Nur bei einem Gen, CCRK, waren deutliche intraspezifische und interspezifische Unterschiede im Grad der DNA-Methylierung festzustellen. Die differentiell methylierten CpG-Positionen lagen innerhalb eines repetitiven Alu-Sg1-Elements. Die Untersuchung des CCRK-Gens liefert eine umfassende Analyse der intra- und interspezifischen Variabilität der DNA-Methylierung einer Alu-Insertion in eine regulatorische Region. Die beobachteten Speziesunterschiede deuten darauf hin, dass die Methylierungsmuster des CCRK-Gens wahrscheinlich in Adaption an spezifische Anforderungen zur Feinabstimmung der CCRK-Regulation unter positiver Selektion evolvieren. Der Promotor des CCRK-Gens ist anfällig für epigenetische Modifikationen durch DNA-Methylierung, welche zu komplexen Transkriptionsmustern führen können. Durch ihre genomische Mobilität, ihren hohen CpG-Anteil und ihren Einfluss auf die Genexpression sind Alu-Insertionen exzellente Kandidaten für die Förderung von Veränderungen während der Entwicklungsregulation von Primatengenen. Der Vergleich der intra- und interspezifischen Methylierung von spezifischen Alu-Insertionen in anderen Genen und Geweben stellt eine erfolgversprechende Strategie dar.

Einfluss neurologischer Krankheitsbilder auf die Vigilanz gemessen mit dem Pupillographischen Schläfrigkeitstest

Zahlreiche neurologische Erkrankungen wie Morbus Parkinson oder Epilepsien sind mit nicht erholsamem Schlaf und erhöhter Tagesschläfrigkeit assoziiert. Andere Erkrankungen wie Multiple Sklerose induzieren zwar Fatigue / Müdigkeit, aber keine objektivierbar erhöhte Einschlafneigung. Aufgrund der komplexen Interaktionen von Grunderkrankung, Krankheitsfolgen und Medikationseffekten differieren subjektive Einschätzung und objektive Maße von Schläfrigkeit oft erheblich. Der pupillographische Schläfrigkeitstest (PST) ist ein effizientes und objektives Verfahren zur Bestimmung der Vigilanz bzw. Tagesschläfrigkeit, für neurologische Patienten unter naturalistischen Bedingungen liegen aber nur wenige Daten vor.