Cis- und trans-Regulation bei Drosophila-T-Box-Genen

Die räumliche und zeitliche Organisation von Genexpression ist für die Entwicklung und das Funktionieren eines jeden Lebewesens von immenser Bedeutung. Dazu laufen eine Vielzahl von Regulationsprozessen auf unterschiedlichen Ebenen ab. In dieser Arbeit wurden im ersten Teil Untersuchungen zur Genregulation des Drosophila optomotor-blind Genes und zur Funktion des Omb Proteins durchgeführt. Eine Mutante, der ein großer Teil der upstream regulatory region (URR) fehlt wurde erzeugt, aus einer Vielzahl von Linien isoliert und molekular charakterisiert. Die biologischen Auswirkungen dieser Deletion werden in Shen et al. (2008) beschrieben. Plasmide zur Erzeugung transgener Fliegen, mit deren Hilfe eine bereits von Sivasankaran et al. (2000) durchgeführte Enhancer-reporter-Analyse vervollständigt werden sollte, wurden hergestellt. Die bereits bekannte Inversion In(1)ombH31 wurde molekular kartiert. Eine Reihe von Konstrukten mit Punktmutationen in der Omb T-Domäne wurden generiert, die unter anderem über deren Funktion hinsichtlich DNA-Protein Interaktion und einer potentiellen Metallionenbindefähigkeit (ATCUN) hin Aufschluss geben sollen. Des Weiteren wurde eine Reihe von P-Element-Deletionslinien auf den Verlust eines alternativen omb Transkriptionsstartpunktes hin untersucht, mit dem Ziel eine vollständige Protein-Nullmutante zur Verfügung zu haben. Der zweite Abschnitt dieser Arbeit befasste sich mit der Erzeugung von Dpp-GFP-Fusionskonstrukten, mit deren Hilfe weitere Erkenntnisse über den Dpp-Langstreckentransport erhofft werden. Es wurde außerdem damit begonnen bei einem weitern Drosophila T-Box Transkriptionsfaktor, Optomotor-blind related gene-1 (Org-1), eine Reihe von Varianten mit homopolymeren polyAlanin und polyGlutamin Expansionen unterschiedlicher Länge herzustellen. Durch Experimente mit diesen Konstrukten soll Aufschluss darüber gewonnen werden, ob Glutamin-Expansionen, wie in der Literatur vorgeschlagen, aktivierend und Alanin-Expansionen in Transkriptionsfaktoren vielleicht reprimierend auf Genaktivität wirken. Letztlich wurden in dieser Arbeit im Rahmen des DROSDEL Projektes (Ryder et al., 2004, 2007) Deletionen in der distalen Hälfte des Chromosomenarms 3R hergestellt. Der DROSDEL Deletionskit, der durch eine Kooperation europäischer Labore entstand stellt der Drosophila Forschung einen umfassenden Satz molekular basengenau definierter Defizienzen zur Verfügung.

The C-4-Dicarboxylate carriers DcuB and DctA of Escherichia coli: function as cosensors and topology

Das fakultativ anaerobe Enterobakterium Escherichia coli nutzt C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Aufnahme der C4-Dicarboxylaten und die Energiekonservierung mittels Fumaratatmung wird durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. Die Sensorhistidinkinase DcuS und der nachgeschaltete Responseregulator DcuR aktivieren bei Verfügbarkeit von C4-Dicarboxylaten die Expression der Gene für den Succinat Transporter DctA, den anaeroben Fumarat/Succinat Antiporter DcuB, die Fumarase B sowie die Fumaratreduktase FrdABCD. Die Transportproteine DctA und DcuB wiederum regulieren die Expression der DcuSR-abhängigen Gene negativ. Fehlen von DctA oder DcuB resultiert bereits ohne Effektor in einer maximalen Expression von dctA bzw. dcuB. Durch gerichtete und ungerichtete Mutagenese wurde gezeigt, dass die Transportfunktion des Carriers DcuB unabhängig von seiner regulatorischen Funktion ist. DcuB kann daher als Cosensor des DcuSR Systems angesehen werden.rnUnter Verwendung von Reportergenfusionen von C-terminal verkürzten Konstrukten von DcuB mit der Alkalischen Phosphatase und der β-Galactosidase wurde die Topologie des Multitransmembranproteins DcuB bestimmt. Zusätzlich wurde die Zugänglichkeit bestimmter Aminosäurereste durch chemische Modifikation mit membran-durchlässigen und membran-undurchlässigen Thiolreagenzien untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse deuten auf die Existenz eines tief in die Membran reichenden, hydrophilen Kanal hin, welcher zum Periplasma hin geöffnet ist. Mit Hilfe der Topologie-Studien, des Hydropathie-Blots und der Sekundärstruktur-Vorhersage wurde ein Modell des Carriers erstellt. DcuB besitzt kurze, periplasmatisch liegende Proteinenden, die durch 12 Transmembranhelices und zwei große hydrophile Schleifen jeweils zwischen TM VII/VIII und TM XI/XII verbunden sind. Die regulatorisch relevanten Reste K353, T396 und D398 befinden sich innerhalb von TM XI sowie auf der angrenzenden cytoplasmatischen Schleife XI-XII. Unter Berücksichtigung der strukturellen und funktionellen Aspekte wurde ein Regulationsmodell erstellt, welches die gemeinsam durch DcuB und DcuS kontrollierte C4-Dicarboxylat-abhängige Genexpression darstellt. rnDer Effekt von DctA und DcuSR auf die Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion und auf die aerobe C4-Dicarboxylat-Aufnahme wurde untersucht. In-vivo FRET-Messungen weisen auf eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Carrier DctA und dem Sensor DcuS hin. Dieses Ergebnis stützt die Theorie der Regulation von DcuS durch C4-Dicarboxylate und durch die Cosensoren DctA bzw. DcuB mittels direkter Protein-Protein Interaktion.rn

The NreABC system of Staphylococcus carnosus combines nitrate and oxygen sensing by an NreA,NreB sensor complex

Staphylococcus carnosus is a facultative anaerobic bacterium which features the cytoplasmic NreABC system. It is necessary for regulation of nitrate respiration and the nitrate reductase gene narG in response to oxygen and nitrate availability. NreB is a sensor kinase of a two-component system and represents the oxygen sensor of the system. It binds an oxygen labile [4Fe-4S]2+ cluster under anaerobic conditions. NreB autophosphorylates and phosphoryl transfer activates the response regulator NreC which induces narG expression. The third component of the Nre system is the nitrate receptor NreA. In this study the role of the nitrate receptor protein NreA in nitrate regulation and its functional and physiological effect on oxygen regulation and interaction with the NreBC two-component system were detected. In vivo, a reporter gene assay for measuring expression of the NreABC regulated nitrate reductase gene narG was used for quantitative evaluation of NreA function. Maximal narG expression in wild type S. carnosus required anaerobic conditions and the presence of nitrate. Deletion of nreA allowed expression of narG under aerobic conditions, and under anaerobic conditions nitrate was no longer required for maximal induction. This indicates that NreA is a nitrate regulated inhibitor of narG expression. Purified NreA and variant NreA(Y95A) inhibited the autophosphorylation of anaerobic NreB in part and completely, respectively. Neither NreA nor NreA(Y95A) stimulated dephosphorylation of NreB-phosphate, however. Inhibition of phosphorylation was relieved completely when NreA with bound nitrate (NreA•[NO3-]) was used. The same effects of NreA were monitored with aerobically isolated Fe-S-less NreB, which indicates that NreA does not have an influence on the iron-sulfur cluster of NreB. In summary, the data of this study show that NreA interacts with the oxygen sensor NreB and controls its phosphorylation level in a nitrate dependent manner. This modulation of NreB-function by NreA and nitrate results in nitrate/oxygen co-sensing by an NreA/NreB sensory unit. It transmits the regulatory signal from oxygen and nitrate in a joint signal to target promoters. Therefore, nitrate and oxygen regulation of nitrate dissimilation follows a new mode of regulation not present in other facultative anaerobic bacteria.