Charakterisierung von T-Zell-Antworten gegen humane Nierenzellkarzinome sowie Identifizierung von HLA-G als tumorassoziiertes Antigen und Immunevasionsmechanismus des Nierenzellkarzinoms

Humane Nierenzellkarzinom-(NZK)-Zelllinien wurden etabliert, um sie zur Generierung von autologen zytotoxischen T-Zelllinien einzusetzen. Erst nach Modifikation mit dem kostimulierenden B7-1-Molekül wurden mit der NZK-Zelllinie MZ1257RC autologe, tumorspezifische T-Zelllinien generiert und charakterisiert. Die Aufklärung eines T-Zell-definierten TAA eines autologen, zytotoxischen T Zellklons wurde mittels Expressionsklonierung einer hergestellten cDNS-Expressionsbank begonnen. Nach in vitro-Sensibilisierung von peripheren Blutmonozyten mit der autologen NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde die HLA-Klasse I-restringierte T Zelllinie XIE6 generiert, die die autologe und verschiedene allogene NZK- sowie Zervixkarzinom-Zelllinien, jedoch nicht autologe Nierenzellen lysiert. Die T Zellen exprimieren TZR Vβ13.6-Ketten und sezernieren GM-CSF und IL-10 nach Antigenstimulation. Jedoch ist die NZK-Zelllinie MZ2733RC wenig sensitiv gegenüber autologen und allogenen Effektorzellen. Erst die Blockade ihrer HLA Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche erhöht ihre Sensitivität gegenüber allogenen lymphokin-aktivierten Killer-Zellen. Verantwortlich dafür können nicht-klassische HLA Klasse Ib-Moleküle, insbesondere HLA-G sein, dessen Transkripte in der RNS der NZK-Zellen, jedoch nicht in Nierenzellen detektiert wurden. In einer detaillierten Studie wurden HLA-G-Transkripte in NZK-Zelllinien (58%), in NZK-Biopsien (80%), und nur in wenigen Nierenepithelbiopsien (10%) nachgewiesen. In der NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde eine konstitutive HLA-G1-Proteinexpression beobachtet, die durch eine IFN-γ-Behandlung induzierbar ist.

The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpräsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehört zur Familie der löslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravenöse Injektion der B16-F10 Zelllinie führte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer höheren Lebenserwartung dieser Mäuse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darüber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Mäusen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden während Änderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die kürzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zusätzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterstützt wurden, erklärt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Mäusen produzierten höhere Mengen an IFN-g während die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Moleküle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstärkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Mäuse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhängigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Mäuse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Mäusen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmäuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfängermäusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Genomische Analyse von natürlichen Killerzell-Rezeptorgenen in nicht-humanen Primaten

Natürliche Killerzell-Rezeptoren, die MHC-Klasse-I-Moleküle binden, sind im Leukozyten Rezeptor Komplex (LRC) und im Natürlichen Killer Komplex (NKC) kodiert. Die Bindung klassischer MHC-Klasse-I-Moleküle erfolgt im Menschen durch die im LRC kodierten polymorphen Killerzell-Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren (KIR) und in Nagetieren durch die im NKC kodierten polymorphen C-Typ Lektin-ähnlichen Ly49-Rezeptoren. Die ebenfalls im NKC kodierten C-Typ Lektin-ähnlichen CD94/NKG2-Rezeptoren sowie der NKG2D-Rezeptor sind sowohl im Menschen als auch in Nagetieren konserviert und wenig polymorph. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das CD94-Ly49L-Intervall der NKC-Region in einem Neuweltaffen, dem Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus), sowie einem Feuchtnasenaffen, dem Grauen Mausmaki (Microcebus murinus), über Screening von BAC-Banken und Sequenzanalyse von BAC-Contigs untersucht. Das CD94-Ly49L-Intervall im Weißbüschelaffen hat eine Länge von 171 kb und weist orthologe Gene zu den humanen NKC-Genen auf. Eine Ausnahme bildet das Gen NKG2CE, welches äquidistant zu den humanen Genen NKG2C und NKG2E ist. NKG2F und Ly49L sind Pseudogene. Expressionsanalysen der NKC-Gene in neun Weißbüschelaffen-Individuen lieferten einen mäßigen Grad an allelischen Polymorphismen. Alternative Spleißprodukte wurden für CD94, NKG2D und NKG2A identifiziert. Für NKG2A wurden verschiedene Transkripte mit potentiell unterschiedlichen Translationsstartpunkten gefunden. Im Grauen Mausmaki beträgt die Länge des CD94-Ly49L-Intervalls 489 kb. CD94 und die NKG2-Gene sind vervielfacht und wesentlich polymorpher als im Menschen und im Weißbüschelaffen. Expressionsanalysen der NKC-Gene wurden im Grauen Mausmaki und einem weiteren madagassischen Lemuren, dem Schwarzweißen Vari (Varecia variegata), durchgeführt und zeigten, dass CD94 und die NKG2-Gene im Vari ebenfalls vervielfacht sind. Die NKG2-Moleküle der Lemuren weisen unterschiedliche Kombinationen an aktivierenden und inhibierenden Signalmotiven auf und üben somit möglicherweise diverse Funktionen aus. Ly49L stellt in den Lemuren einen potentiell funktionellen inhibierenden Rezeptor dar und NKG2D besitzt im Vergleich zum humanen NKG2D-Protein eine verkürzte Zytoplasmaregion. Alternative Spleißprodukte der NKC-Gene existieren auch in den Lemuren. Darüber hinaus wurden mehrere CD94-Gene in einem weiteren Feuchtnasenaffen, dem Potto (Perodicticus potto) und einem Trockennasenaffen, dem Philippinen-Koboldmaki (Tarsius syrichta), nachgewiesen. Ein Alu-Element, welches ausschließlich in Intron 4 der CD94-Sequenzen des Philippinen-Koboldmakis auftritt, deutet darauf hin, dass sich CD94 in der Linie der Koboldmakis und in der Linie der Feuchtnasenaffen unabhängig voneinander vervielfacht hat. Die vervielfachten, polymorphen CD94/NKG2-Rezeptoren der niederen Primaten stellen möglicherweise das funktionelle Äquivalent zu den polymorphen KIR der höheren Primaten und den polymorphen Ly49-Rezeptoren der Nagetiere dar.

An interferon regulatory factor element controls the major immune modulator of murine cytomegalovirus

Immune modulation by herpesviruses, such as cytomegalovirus, is critical for the establishment of acute and persistent infection confronting a vigorous antiviral immune response of the host. Therefore, the action of immune-modulatory proteins has long been the subject of research, with the final goal to identify new strategies for antiviral therapy.rnIn the case of murine cytomegalovirus (mCMV), the viral m152 protein has been identified to play a major role in targeting components of both the innate and the adaptive immune system in terms of infected host-cell recognition in the effector phase of the antiviral immune response. On the one hand, it inhibits cell surface expression of RAE-1 and thereby prevents ligation of the activating natural killer (NK)-cell receptor NKG2D. On the other hand, it decreases cell surface expression of peptide-loaded MHC class I molecules thereby preventing antigen presentation to CD8 T cells. Ultimately, the outcome of CMV infection is determined by the interplay between viral and cellular factors.rnIn this context, the work presented here has revealed a novel and intriguing connection between viral m152 and cellular interferon (IFN), a key cytokine of the immune system: rnthe m152 promoter region contains an interferon regulatory factor element (IRFE) perfectly matching the consensus sequence of cellular IRFEs.rnThe biological relevance of this regulatory element was first suggested by sequence comparisons revealing its evolutionary conservation among various established laboratory strains of mCMV and more recent low-passage wild-derived virus isolates. Moreover, search of the mCMV genome revealed only three IRFE sites in the complete sequence. Importantly, the functionality of the IRFE in the m152 promoter was confirmed with the use of a mutant virus, representing a functional deletion of the IRFE, and its corresponding revertant virus. In particular, m152 gene expression was found to be inhibited in an IRFE-dependent manner in infected cells. Essentially, this inhibition proved to have a severe impact on the immune-modulatory function of m152, first demonstrated by a restored direct antigen presentation on infected cells for CD8 T-cell activation. Even more importantly, this effect of IRFE-mediated IFN signaling was validated in vivo by showing that the protective antiviral capacity of adoptively-transferred, antigen-specific CD8 T cells is also significantly restored by the IRFE-dependent inhibition of m152. Somewhat curious and surprising, the decrease in m152 protein simultaneously prevented an enhanced activation of NK cells in acute-infected mice, apparently independent of the RAE-1/NKG2D ligand/receptor interaction but rather due to reduced ‘missing-self’ recognition.rnTaken together, this work presents a so far unknown mechanism of IFN signaling to control mCMV immune modulation in acute infection.rnrn

Evaluation eines humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentzündung

Aus der zunehmenden Prävalenz allergischer Erkrankungen vor allem in den Industrienationen ergibt sich ein erhöhter Bedarf an Grundlagenforschung im Bereich von Allergie und Asthma sowie der Entwicklung innovativer Therapiestrategien. In der vorliegenden Dissertation wurden die immundefizienten Mausstämme NOD-Scid und NOD-Scid gc als vielversprechender translationaler Schritt zwischen dem reinen Tiermodell und der Erprobung neuer Therapieansätze an Probanden in klinischen Studien beleuchtet. Im experimentellen Verlauf der Arbeit wurde ein humanisiertes Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung zunächst in immundefizienten NOD-Scid und darauffolgend in NOD-Scid gc Mäusen etabliert. Diese Mausstämme zeichnen sich durch das Nichtvorhandensein von B- und T-Zellen aus. Im NOD-Scid gc Stamm resultiert aus einer zusätzlichen Mutation des Gens für die gamma-Kette des IL-2 Rezeptors der Verlust von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), was die Immunität in diesem Stamm weiter herabsetzt und eine Humanisierung erleichtert. Die Humanisierung der Mäuse erfolgte durch die intraperitoneale Injektion von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die unter Anwendung der Ficoll-Dichtezentrifugation aus dem Blut von Probanden isoliert wurden. Für die Gewinnung der PBMCs wurden zum einen Asthma-Patienten mit einer hochgradigen Sensibilisierung gegen Birkenpollen herangezogen. Zum anderen wurden in Kontrollexperimenten PBMCs nicht-allergischer Probanden verwendet. Während sich für den NOD-Scid Stamm 80 Millionen PBMCs als angemessene Transferzahl erwiesen, reichten für die Rekonstitution des NOD-Scid gc Stammes 5 Millionen PBMCs aus. Eine Analyse der Tiere erfolgte 24 Tage nach Injektion der humanen Zellen. Der Transfer der PBMCs allergischer Asthmatiker führte besonders nach additiver Applikation des Birkenallergens sowie des humanen rekombinanten Zytokins IL-4 und darauffolgender nasaler allergener Provokation zu einer starken pulmonalen Entzündung in den Mäusen. Die nasale Allergenprovokation an den Tagen 20-22 nach PBMC-Transfer erwies sich für das Aufkommen der Inflammation als unbedingt erforderlich. Die nasale Provokation mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mündete in einer herabgesetzten Inflammation ohne Ausprägung einer Atemwegsüberempfindlichkeit (AHR), reduzierten Zellzahlen in der bronchoalveolären Lavage (BAL) sowie verminderten Frequenzen humaner Zellen in den Lungen von Versuchstieren, die mit atopischen PBMCs supplementiert mit Birkenallergen und IL-4 rekonstituiert wurden. Die Allergenabhängigkeit des etablierten Modells wurde anhand von Experimenten untermauert, die verdeutlichten, dass ein Transfer von PBMCs nicht-allergischer Probanden trotz Zugabe des Allergens und humanem IL-4 keine Atemwegsinflammation auslöste. Bei den humanen Zellen, die an Tag 24 nach Rekonstitution in den Mäusen detektiert werden konnten, handelte es sich hauptsächlich um T-Zellen. Innerhalb dieser CD3+ T-Zellen konnten CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert werden. Depletionsexperimente, in denen nach Gewinnung der PBMCs aus dem Blut der Probanden verschiedene T-Zellsubpopulationen (CD3+, CD4+, CD8+) eliminiert wurden, führten zu dem Befund, dass die allergische Atemwegsentzündung in dem System von humanen CD4+ T-Zellen abhängig war. Nach der Etablierung des humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentzündung wurde das System zur Analyse des suppressionsfördernden Potentials des HIV-1 - Hüllproteins gp120 genutzt. Die Applikation von gp120 führte zu einer Reduktion der Atemwegsinflammation. Dies äußerte sich in einer Aufhebung der AHR, verminderten Zellzahlen in der BAL sowie dem reduzierten Einstrom humaner T-Zellen in die Lungen der rekonstituierten Tiere. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die anti-inflammatorische Wirkung des gp120 strikt von der Anwesenheit regulatorischer T-Zellen (Tregs) innerhalb der für die Humanisierung genutzten PBMCs abhängig war. Eine Depletion der Tregs vor Transfer in die Mäuse führte zum Verlust der anti-inflammatorischen Effekte des gp120. Diese Ergebnisse sprechen für die Modulation regulatorischer T-Zellen als hoffnungsvolle Maßnahme in der Behandlung allergischer Erkrankungen. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen innovative Ansätze zur Analyse neuer Therapiestrategien in einem Testsystem, dass die Erforschung humaner Zellinteraktionen sowie die Wirkung potentieller Arzneistoffe auf humane Zellen unter in vivo Bedingungen erlaubt.