Einfluß von Ernährung und Umweltfaktoren auf oxidative DNA-Schäden

Nach heutigen Erkenntnissen sind für die Krebsentstehung Mutationen in Genen somatischer Zellen verantwortlich, die vor allem durch chemische Modifikationen der DNA (DNA-Schäden) hervorgerufen werden. Als DNA-schädigende Agentien sind besonders reaktive Sauerstoffspezies (ROS) von Bedeutung, die sowohl endogen, z.B. in der Lipidperoxidation und der mitochondrialen Atmungskette, als auch exogen, z.B. durch Xenobiotika und Strahlung, entstehen können. Der stets in jeder Zelle vorhandene Untergrundspiegel an DNA-Modifikationen ergibt sich aus dem Gleichgewicht zwischen Schadensbildung und den zellulären antioxidativen Schutz- und den Reparaturmechanismen. Ziel dieser Arbeit war, die Beeinflussung oxidativer DNA-Schäden durch verschiedene, vom Menschen zumeist oral aufgenommene Stoffe (Ascorbinsäure, Derivat des Carazostatin (MMPDCD), Eicosapentaensäure (EPA) und Ethanol) unter Bedingungen ohne weitere exogene Schädigung und unter zusätzlich induziertem oxidativem Stress zu untersuchen. Zur Induktion von oxidativen Stress wurden AS52-Zellen (CHO-Zellen) mit UVB, sichtbarem Licht oder sichtbarem Licht und Photosensibilisator bestrahlt. Die Bestimmung der oxidativen DNA-Schäden in den Zellen (AS52 oder humane Lymphozyten) erfolgte mit Hilfe der Alkalischen Elution, wobei als Sonde das Fpg-Protein, eine DNA-Reparaturendonuklease, die vor allem 8-Hydroxyguanin erkennt, verwendet wurde. Darüberhinaus wurde der Einfluß der jeweiligen Vorbehandlung auf die Bildung von Mikrokernen und auch deren Zytotoxizität untersucht. Außerdem lag ein besonderes Augenmerk auch auf Untersuchungen von Effekten in humanen Lymphozyten in vivo.Bei den Untersuchungen an kultivierten Säugerzellen zeigte sich bei keiner Substanz in dem untersuchten Konzentrationsbereich ein Einfluß auf oxidative DNA-Schäden. Lediglich bei MMPDCD war ein geringer, protektiver Effekt zu erkennen, der abhängig von der eingesetzten Konzentration war. Dagegen konnte die Induktion von Mikrokernen sowohl durch Präinkubation mit Vitamin C, EPA als auch mit MMPDCD effektiv verhindert werden, obwohl sie z.T. die spontane Mikrokernrate erhöhten. In den in vivo Studien hatte weder eine akute Gabe von Vitamin C noch eine dreimonatige Supplementation mit EPA einen Einfluß auf die Untergrundspiegel oxidativer DNA-Schäden in humanen Lymphozyten. Bei der Studie zum Einfluß von chronischem Alkoholmißbrauch auf oxidative DNA-Schäden in Lymphozyten fand sich in der Patientengruppe ein signifikant erhöhter Spiegel an Schäden. Dieser erniedrigte sich nach erfolgter Entgiftung nicht auf das Niveau der Kontrollgruppe sondern erhöhte sich noch weiter.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß Vitamin C und EPA zwar in vitro einen teilweise protektiven Effekt haben, sich dieser aber nicht in vivo finden läßt. Außerdem hat Ethanol eine schädigende Wirkung auf den DNA-Schaden in vivo, was dem vielfach propagierten protektiven Effekt alkoholischer Getränke widerspricht.

Endogene DNA-Schädigung als Ursache genetischer Instabilität

Zusammenfassung Diese Arbeit beschreibt Untersuchungen über die zellulären Mechanismen, die zur Bildung dieser DNA-Schäden führen, sowie über die biologischen Auswirkungen dieser Schäden. Die Untersuchungen zu Uracil in der DNA wurden in ung-knockout-MEFs und Mäusen durchgeführt, die es erlauben, die Konsequenzen eines Ausfalls der wichtigsten Reparaturglykosylase für Uracil zu beleuchten. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Akkumulation von Uracil in den ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zum Wildtyp. In frisch isolierten Leber- und Milzzellen der Mäuse konnte dieser genotypspezifische Unterschied, wenn auch weniger ausgeprägt, ebenso beobachtet werden, nicht jedoch in reifen Spermien. Dieser gewebespezifische Unterschied und die quantitativ stärker ausgeprägte Akkumulation in ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zu den Mäusegeweben gab Anlass zur Vermutung, dass die Proliferation der Zellen für den Haupteintrag an Uracil in die DNA verantwortlich ist. Erstmals konnte in Versuche mit konfluenten (nicht mehr proliferierenden) ung-/--Mausfibroblasten gezeigt werden, dass nicht die spontane hydrolytische Desaminierung von Cytosin, sondern der Fehleinbau von dUMP während der DNA-Replikation die Hauptquelle für Uracil in der DNA von Säugerzellen darstellt. Da der Uracilmetabolismus ein wichtiges Target in der Chemotherapie ist, lag es nahe, das zur Verfügung stehende ung-knockout-Modell der MEFs zur Untersuchung mit Fluorpyrimidinen, die als Zytostatika verwendet werden, einzusetzen. Da bisher die Ursachen der beobachteten Apoptose der Tumorzellen und aller anderen metabolisch hochaktiven Zellen eines behandelten Organismus noch nicht vollständig verstanden ist, wurden diese Zellen mit verschiedenen Fluorpyrimidinen behandelt, die als Thymidylatsynthasehemmer die de novo Synthese von Thymidin unterbinden. Es konnte gezeigt werden, dass ung-/- Mausfibroblasten, im Gegensatz zu ung+/+ Mausfibroblasten, verstärkt Uracil in der DNA akkumulieren. Obwohl die ung+/+ Mausfibroblasten keine erhöhten Uracil-Spiegel in der DNA aufwiesen, zeigten sie bei Inkubation mit einem der beiden Thymidylatsynthasehemmern, 5-Fluoruracil (5-FU), die gleiche Sensitivität in einem nachfolgenden Proliferationsversuch wie die ung-/- Mausfibroblasten. Dies lässt darauf schließen, dass weder Reparatur noch Einbau von Uracil in die DNA für die beobachtete Toxizität dieser Zytostatika notwendig sind. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung des DNA-schädigenden Potenzials endogener ROS, die aus dem Fremdstoffmetabolismus stammen. Dazu wurden V79-Zellen verwendet, die mit dem humanen Enzym Cytochrom 2E1 (CYP2E1) transfiziert wurden (V79 CYP2E1) sowie Zellen, die ebenfalls durch Transfektion das humane Enzym Cytochromreduktase (auch Oxidoreduktase genannt) überexprimieren (V79 hOR). Beide Enzyme sind zusammen an der Hydroxylierung von Fremdstoffen beteiligt, bei der die Reduktion von molekularem Sauerstoff durch Übertragung von zwei Elektronen notwendig ist. Wird anstatt zweier Elektronen in Folge nur eines auf den Sauerstoff übertragen, so führt dieser von der Substratoxygenierung enkoppelte Vorgang zur Bildung von Superoxid. Daher galt es zu klären, ob das so erzeugte Superoxid und daraus gebildete ROS in der Lage sind, die DNA zu schädigen. Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von CYP2E1 nicht zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden führt und die Metabolisierung von Ethanol durch dieses Enzym ebenfalls keine DNA-Modifikationen verursacht. Die Überexpression der Cytochromreduktase hingegen führte gegenüber dem Wildtyp zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer Basenmodifikationen nach Depletion von Glutathion, einem wichtigen zellulären Antioxidans. Im Mikrokerntest, der gentoxische Ereignisse wie Chromosomenbrüche in Zellen aufzeigt, zeigte sich schon ohne Glutathion-Depletion eine doppelt so hohe Mikrokernrate im Vergleich zum Wildtyp. In weiteren Versuchen wurden die V79-hOR-Zellen mit dem chinoiden Redoxcycler Durochinon inkubiert, um zu untersuchen, ob das vermutlich durch die Reduktase vermittelte Redoxcycling über Generierung von ROS in der Lage ist, einen oxidativen DNA-Schaden und Toxizität zu verursachen. Hier zeigte sich, dass die Überexpression der Reduktase Voraussetzung für Toxizität und den beobachteten DNA-Schaden ist. Die Wildtyp-Zellen zeigten weder einen DNA-Schaden noch Zytotoxizität, auch eine zusätzliche Glutathion-Depletion änderte nichts an dem Befund. Die V79-hOR-Zellen hingegen reagierten auf die Inkubation mit Durochinon mit einer konzentrationsabhängigen Zunahme der Einzelstrangbrüche und oxidativen Basenmodifikationen, wobei sich der DNA-Schaden durch vorherige Glutathion-Depletion verdoppeln ließ.

Radiochemical aspects of production and processing of radiometals for preparation of metalloradiopharmaceuticals

Radiometals play an important role in nuclear medicine as involved in diagnostic or therapeutic agents. In the present work the radiochemical aspects of production and processing of very promising radiometals of the third group of the periodic table, namely radiogallium and radiolanthanides are investigated. The 68Ge/68Ga generator (68Ge, T½ = 270.8 d) provides a cyclotron-independent source of positron-emitting 68Ga (T½ = 68 min), which can be used for coordinative labelling. However, for labelling of biomolecules via bifunctional chelators, particularly if legal aspects of production of radiopharmaceuticals are considered, 68Ga(III) as eluted initially needs to be pre-concentrated and purified. The first experimental chapter describes a system for simple and efficient handling of the 68Ge/68Ga generator eluates with a cation-exchange micro-chromatography column as the main component. Chemical purification and volume concentration of 68Ga(III) are carried out in hydrochloric acid – acetone media. Finally, generator produced 68Ga(III) is obtained with an excellent radiochemical and chemical purity in a minimised volume in a form applicable directly for the synthesis of 68Ga-labelled radiopharmaceuticals. For labelling with 68Ga(III), somatostatin analogue DOTA-octreotides (DOTATOC, DOTANOC) are used. 68Ga-DOTATOC and 68Ga-DOTANOC were successfully used to diagnose human somatostatin receptor-expressing tumours with PET/CT. Additionally, the proposed method was adapted for purification and medical utilisation of the cyclotron produced SPECT gallium radionuclide 67Ga(III). Second experimental chapter discusses a diagnostic radiolanthanide 140Nd, produced by irradiation of macro amounts of natural CeO2 and Pr2O3 in natCe(3He,xn)140Nd and 141Pr(p,2n)140Nd nuclear reactions, respectively. With this produced and processed 140Nd an efficient 140Nd/140Pr radionuclide generator system has been developed and evaluated. The principle of radiochemical separation of the mother and daughter radiolanthanides is based on physical-chemical transitions (hot-atom effects) of 140Pr following the electron capture process of 140Nd. The mother radionuclide 140Nd(III) is quantitatively absorbed on a solid phase matrix in the chemical form of 140Nd-DOTA-conjugated complexes, while daughter nuclide 140Pr is generated in an ionic species. With a very high elution yield and satisfactory chemical and radiolytical stability the system could able to provide the short-lived positron-emitting radiolanthanide 140Pr for PET investigations. In the third experimental chapter, analogously to physical-chemical transitions after the radioactive decay of 140Nd in 140Pr-DOTA, the rapture of the chemical bond between a radiolanthanide and the DOTA ligand, after the thermal neutron capture reaction (Szilard-Chalmers effect) was evaluated for production of the relevant radiolanthanides with high specific activity at TRIGA II Mainz nuclear reactor. The physical-chemical model was developed and first quantitative data are presented. As an example, 166Ho could be produced with a specific activity higher than its limiting value for TRIGA II Mainz, namely about 2 GBq/mg versus 0.9 GBq/mg. While free 166Ho(III) is produced in situ, it is not forming a 166Ho-DOTA complex and therefore can be separated from the inactive 165Ho-DOTA material. The analysis of the experimental data shows that radionuclides with half-life T½ < 64 h can be produced on TRIGA II Mainz nuclear reactor, with specific activity higher than any available at irradiation of simple targets e.g. oxides.

Generierung und Prozessierung oxidativer DNA-Schäden

Generierung und Prozessierung oxidativer DNA Schäden --- Ziel dieser Arbeit war es, adaptive Antworten der Zellen auf einen DNA Schädigung zu untersuchen. Hierzu wurden Experimente zur Reparatur oxidierter Basen (Substrate der Basen Exzisions Reparatur (BER)) oder von Pyrimidindimeren (Substrate der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER)) nach einer Vorbehandlung mit DNA-schädigender Agenzien durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl eine Vorbehandlung mit einer alkylierenden als auch mit einer oxidierenden Substanz zu einer adaptiven Erhöhung des zellulären Glutathionspiegels führte, die 16 h nach der Schädigung ihr Maximum erreichte. Jedoch waren die 8-oxoG Glykosylaseaktivitäten über einen Zeitraum von 18 h konstant. Diese Effekte waren unabhängig davon, ob Maus Embryofibroblasten, primäre oder p53 profiziente menschliche Zellen verwendet wurden. Die BER war ebenfalls in keiner der verschiedenen Zelllinien signifikant verbessert. Die adaptive Antwort bezüglich der Glutathionspiegel war also nicht mit einer entsprechenden Veränderung bei der DNA-Reparatur verbunden. Folglich ist die Reparatur von oxidativen DNA-Schäden durch eine vorausgehende Schädigung nicht induzierbar. Der zweite Teil der Untersuchungen zu der Reparatur beschäftigte sich mit der NER. Hierzu wurde die Reaktivierung eines mit UVB-Strahlung geschädigten Plasmids untersucht. Als Wirtszellen fungierten primäre menschliche Fibroblasten und Keratinozyten, die entweder mit UVB vorbehandelt oder ungeschädigt waren. Auch für die NER konnte keine signifikante Beschleunigung der Reparatur von Pyrimidindimeren durch eine Vorbehandlung festgestellt werden. Die Reaktivierung erfolgte ferner unabhängig vom p53-Status der Zellen, wie Versuche mit p53-siRNA zeigten. Neben der Prozessierung war die Generierung oxidativer DNA Schäden Gegenstand der Arbeit. Die verwendete Substanz Tirapazamin (TPZ) ist ein für hypoxische Zellen selektives, neues Zytostatikum und befindet sich momentan in Phase 2/3 der klinischen Prüfung. Ziel war es die von TPZ verursachten DNA Modifikationen zu charakterisieren, sowie die Toxizität und Genotoxizität zu untersuchen. Da es Hinweise auf eine Aktivierung von TPZ über eine Oxidoreduktase (OR) gab, wurden die Experimente in Wildtyp und hOR überexprimierenden Zellen durchgeführt. Die Quantifizierung der verursachten DNA-Modifikationen zeigte, dass der von TPZ verursachte Schaden in Zellen mit hOR erhöht war. Das erhaltene Schadensprofil der durch TPZ verursachten DNA-Modifikationen war dem Schadensprofil von durch Gamma-Strahlung intrazellulär verursachten Hydroxylradikalen sehr ähnlich. Da es nach der Aktivierung von TPZ durch eine OR zu einer Abspaltung von Hydroxylradikalen kommt, bestätigte dies den vermuteten Mechanismus. Weitere Untersuchungen mit t-Butanol, einem Hydroxylradikal Fänger, ergaben eine verminderte DNA-Schädigung, was ebenfalls für eine DNA-Schädigung durch Hydroxylradikale spricht. Untersuchungen zur Mutagenität zeigten das die Mutationsrate in Zellen mit hOR um das 4 fache erhöht ist. Erstaunlich war jedoch, dass der im gleichen Ausmaß von Gamma-Strahlung verursachte DNA-Schaden für die beobachtete Toxizität dieser verantwortlich war, während bei TPZ unter den gleichen Bedingungen keine Toxizität vorlag. Erklärt werden könnte die erhöhte Toxizität und Mutagenität durch so genannte geclusterte DNA-Schäden, die von Gamma-Strahlen, nicht jedoch von TPZ gebildet werden. Nach einer verlängerten Inkubation wurde sowohl für die Toxizität als auch für die Genotoxizität erneut ein verstärkender Effekt durch die OR bestätigt. Überraschend war weiterhin die von der OR unabhängige Generierung von Doppelstrangbrüchen, für die demnach ein grundsätzlich anderer Mechanismus, wie zum Beispiel eine direkte Interaktion mit der Topoisomerase II, angenommen werden muss.

Untersuchungen zur Reparatur und Mutagenität oxidativer DNA-Schäden in vivo und deren Bedeutung für die Kanzerogenese

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung, welche Rolle endogen gebildete oxidative DNA-Modifikationen bei der Kanzerogenese spielen. Dazu wurden Cockayne Syndrom B-knockout-Mäuse (Csb-/-), 8-Hydroxyguanin-DNA-Glykosylase-knockout-Mäuse (Ogg1-/-) und Csb-/-/Ogg1-/- Mäuse generiert, die das bakterielle lacI-Gen (Big Blue®) tragen und somit für in vivo Mutationstests eingesetzt werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass es in den Lebern der Ogg1-/- Mäuse zu einem 2,1-fachen und in Csb-/-/Ogg1-/- Mäusen zu einem statistisch signifikanten 3,3-fachen Anstieg der Mutationsfrequenz kommt. Die gefundene Erhöhung der Mutationsfrequenz war vor allem auf eine Erhöhung der G:C zu T:A Transversionen zurückzuführen, die typischerweise aus nicht repariertem 8 Hydroxyguanin (8-oxoG) entstehen. Aus mechanistischer Sicht verdeutlichen die Ergebnisse, dass OGG1 das primäre Abwehrsystem gegen oxidative DNA-Modifikationen darstellt und dass das CSB-Protein einen Ausfall von OGG1, selbst in nicht transkribierter DNA, teilweise kompensieren kann. Aus der Korrelation der gefundenen oxidativen DNA-Schäden - bestimmt mittels Alkalischer Elution und der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fpg-Protein) - mit der Mutationsfrequenz konnte abgeleitet werden, dass bereits weniger als 0,2 Fpg-sensitive DNA-Modifikationen pro 1 Million Basenpaare ausreichen, die spontane Mutationsfrequenz in vivo zu verdoppeln. Zur Untersuchung, welche Rolle die erhöhte Mutationsfrequenz bei der Krebsentstehung spielt, wurden Csb-/-/Ogg1-/- und Wildtyp-Mäuse mit dem Peroxisomenproliferator und spezifischem Leberpromotor WY-14,643 behandelt um spontan initiierte Hepatozyten zur Proliferation anzuregen. Als Endpunkt einer malignen Entartung wurde das Auftreten von Glucose-6-Phosphatase positiven und negativen Läsionen beobachtet. Es zeigte sich, dass Csb-/-/Ogg1-/- Mäuse signifikant mehr enzymveränderte Läsionen in ihren Lebern aufwiesen, als die Wildtyp-Kontrollen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass endogen gebildete oxidative DNA-Modifikationen und daraus resultierende Mutationen grundsätzlich einen erheblichen Anteil zur hohen spontanen Krebsinzidenz in der Bevölkerung leisten könnten.

Ortsaufgelöste Speziation von Schwermetallen in geogenen Proben mit Röntgenabsorptionsspektrometrie (my-XAS)

Die Vergesellschaftung und Bindungsform von Arsen in Düngekalk wurde durch chemische und mineralogische Analysen sowie XANES/EXAFS-Messungen untersucht. Die durch-schnittliche As-Konzentration im Düngekalk (70 mg/kg) überschreitet den Grenzwert der DüMV (40 mg/kg). Arsen ist in Mn- (Romanechit) und Fe-Dendriten (Goethit, Ferrihydrit) angereichert. Seine Oxidationsstufe ist jeweils 5+. µ-EXAFS-Untersuchungen ergaben Hin-weise auf zweizähnige und einzähnige mononukleare Durchdringungskomplexe mit Eisen-oxid. Das Mobilisierungsverhalten von Arsen wurde durch sequentielle Extraktion des Dün-gekalks und Mobilisierungsversuche mit wassergesättigtem Boden untersucht. Die Lösung erfolgte vorwiegend im dritten Extraktionsschritt gemeinsam mit kristallinen Eisenoxiden. Unter moderat anoxischen Bedingungen war im Boden keine zusätzliche Mobilisierung von Arsen aus dem Düngekalk nachweisbar. Erhöhte As-Konzentrationen und As3+-Anteile im Porenwasser traten bei niedrigem Eh unabhängig von Kalkzugabe auf. Eine Kopplung des Arsen-Grenzwerts an den Eisenoxidgehalt erscheint sinnvoll. Ein Messaufbau für Mikro-XAS Imaging wurde in Betrieb genommen. Er ermöglicht die si-multane Erfassung einer Probenfläche von 26,6×6,6 mm² wahlweise im Transmissions- oder Fluoreszenzmodus mit der räumlichen Auflösung 52×52 µm² durch eine CCD-Kamera. Zur Datenverarbeitung wurden IDL-Programme sowie die Fernerkundungssoftware ENVI ver-wendet. Die Messergebnisse zeigen weniger Störungen und Rauschen als die Ergebnisse frü-herer Messungen mit einem Prototyp. Die Ergebnisse und Erfahrungen der Messungen liefern Hinweise für die weitere erfolgreiche Nutzung des Messaufbaus.

Entwicklung einer Online-Kopplung der Gelelektrophorese mit der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie und deren Anwendung in der Bioanalytik

Die Elementmassenspektrometrie wurde in den letzten Jahren sehr erfolgreich zur Aufklärung verschiedener Fragestellungen in der Bioanalytik eingesetzt. Hierbei spielen vor allem Kopplungstechniken von Trennmethoden wie der Flüssigchromatographie (LC) oder der Kapillarelektrophorese (CE) mit der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) als Multielementdetektor mit hervorragenden Quantifizierungseigenschaften eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung von Biopolymeren und deren Wechselwirkung mit verschiedenen Metallen. So wurden beispielsweise verschiedene Methoden für die Trennung und Detektion von Metalloproteinen oder DNA-Metall-Addukten in unterschiedlichen Probenmaterialien entwickelt. Die traditionelle und leistungsstärkste Trennmethode für Biopolymere aller Art, die Gelelektrophorese, wurde jedoch bislang nicht in einem Online-Verfahren an die ICP-MS gekoppelt, um solche Fragestellungen zu bearbeiten. Verschiedene Versuche auf der Basis der Laserablation wurden in diese Richtung unternommen, wobei diese Techniken als sehr umständlich und zeitaufwändig anzusehen sind. In dieser Arbeit wird erstmals die technische Realisierung einer Online-Kopplung der Gelelektrophorese mit der ICP-MS beschrieben. Das System basiert auf einem Prinzip aus der präparativen Gelelektrophorese, in welcher eine kontinuierliche Elution der getrennten Komponenten aus dem Gel während der laufenden Elektrophorese durchgeführt wird. Die eluierten Komponenten werden mit dem Elutionspuffer direkt in das Zerstäubersystem des ICP-MS geführt. Die ersten Untersuchungen wurden am Beispiel der Fragemente von doppelsträngiger DNA (dsDNA) durchgeführt. Kommerziell erhältliche Standardlösungen wurden mit der Online-GE-ICP-MS mittels Detektion von 31P an einem hochauflösenden Massenspektrometer mit einer Massenauflösung von 4000 analysiert. Die Trennbedingungen (z.B. pH-Wert oder Ionenstärke der Pufferlösungen) wurden für die Trennung von dsDNA-Fragementen in Agarosegelen optimiert und auf verschiedene dsDNA-Fragmente angewandt. In einem nächsten Schritt wurden die Quantifizierungsmöglichkeiten für Biopolymere untersucht. Sehr kleine Mengen an dsDNA konnten mit einer Präzision von weniger als 3% quantifiziert werden. Hierfür kamen verschiedene Möglichkeiten der externen Kalibration zum Einsatz, wie der Kalibration mit einem Phosphat-Standard oder einem kommerziell erhältlichen quantitativen dsDNA-Standard. Um das Potenzial der entwickelten Methode für die Untersuchung von Biopolymer-Metall-Wechselwirkungen zu demonstrieren, wurden Oligonukleotide mit Cisplatin unter physiologischen Bedingungen inkubiert und die Reaktionsprodukte mit der Online-GE-ICP-MS mittels 31P- und 195Pt-Detektion untersucht. Verschiedene Cisplatin-Oligonukleotid-Addukte konnten auf diese Weise beobachtet werden, was zur Identifizierung die Anwendung der MALDI-TOF-MS als komplementärer Form der Massenspektrometrie notwendig machte. Abschließend wurde die Isotopenverdünnungsanalyse zum Zweck der Quantifizierung herangezogen.

Einfluss von oxidativem Stress auf die DNA-Reparatur in Säugerzellen

Gegenstand dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel zwischen DNA-Reparatur und zellulärem anitoxidativen Abwehrsystem in Melanomzellen und gesunden Hautfibroblasten näher zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die dominierenden DNA-Läsionen im Falle einer Bestrahlung mit sichtbarem Licht (400 – 800 nm) Fpg-sensitive Läsionen, zu denen die Basenmodifikation 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG) gehört, und im Falle der UVA-Bestrahlung Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPDs) sind. Sowohl Melanomzellen als auch Hautfibroblasten waren problemlos in der Lage, die durch sichtbares Licht und UVA-Strahlung induzierten oxidativen DNA-Modifikationen zu reparieren. Jedoch reagierten Melanomzellen in einer adaptiven Antwort mit einer Erhöhung ihres Glutathion-Gehalts auf ein Maximum (nach circa 10 - 14 h) nach Bestrahlung mit sichtbarem Licht, wohingegen die Hautfibroblasten einen massiven Einbruch direkt nach Bestrahlung und eine extrem lange Erholungsphase über 48 h aufzuweisen hatten. Die darauffolgende Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität der Zellen unter Bedingungen von oxidativem Stress mit vorangegangener Depletion intrazellulären Glutathions zeigten eine dramatische, nahezu vollständige Hemmung der Reparatur durch UVA- bzw. Sonnenlicht-induzierter Fpg-sensitiver DNA-Modifikationen (8-oxoG) - sowohl in Melanomzellen als auch in Hautfibroblasten. Dieser Effekt ließ sich durch den Zusatz von Dithiothreitol (DTT), nach erfolgter Bestrahlung der Glutathion-depletierten Zellen, wieder komplett revertieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass an der Reparatur ein redoxempfindliches Protein oder zellulärer Cofaktor beteiligt sein muß. Zudem konnte durch Untersuchungen der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und der Einzelstrangbruchreparatur nach dem gleichen Versuchsdesign gezeigt werden, dass es sich hierbei sehr wahrscheinlich um einen für die Basenexzisionsreparatur (BER) von 7,8-dihydro-8-oxo-guanine (8-oxoG) exklusiven Effekt handelte. Zwei der wichtigsten Reparaturproteine der BER, nämlich hOGG1 und APE1, wurden anschließend auf ihre Funktionsfähigkeit hin untersucht, da es naheliegend war, dass der Reparaturhemmung ein Funktionsverlust eines dieser beiden Enzyme zugrunde liegen könnte. Im Falle des APE1-Proteins konnte dies ausgeschlossen werden, da mit Hilfe der Alkalischen Elution die volle Funktionsfähigkeit für die Reparatur von AP-Läsionen nachgewiesen werden konnte. Interessanterweise zeigte aber das hOGG1-Protein eine zwischen der dritten und vierten Stunde nach Bestrahlung Glutathion-depletierter Zellen stark abfallende Aktivität der 8-oxoG-Glykosylasefunktion. Die Western-Blot-Analyse ergab allerdings keinen Hinweis auf eine Proteinoxidation von hOGG1. Möglicherweise wird nicht hOGG1 selbst, wohl aber ein anderes, für eine konzertierte Abfolge der einzelnen Reparaturschritte entscheidend notwendiges Protein innerhalb der Zelle durch ROS leicht oxidiert. In jedem Fall bleibt festzustellen, dass Glutathion eine wichtige Aufgabe hinsichtlich einer voll funktionsfähigen Basenexzisionreparatur zuzukommen scheint. Die Ergebnisse unterstreichen die mögliche Bedeutung von oxidativem Stress für die Entstehung von Krebs durch Sonnenlicht, insbesondere durch UVA, da die durch die Strahlung (und eventuell auftretende Entzündung) gebildeten ROS nicht nur DNA-Schäden induzieren, sondern auch ihre Reparatur verhindern können.

Einfluss von Resveratrol auf oxidative DNA-Schäden und Mutagenese in vivo

Oxidative DNA-Basenmodifikationen, wie 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), werden endogen in allen Zellen gebildet. Die beobachtbaren Spiegel ergeben sich aus dem Gleichgewicht zwischen der Bildung durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), sowie der gleichzeitigen Reparatur der DNA-Schäden. Durch ihr hohes mutagenes Potential, tragen oxidative DNA-Basenmodifikationen zur spontanen Mutationsrate bei. Der Ausfall wichtiger DNA-Reparaturmechanismen führt in Ogg1(-/-)Csb(-/-)-Knockout-Mäusen zu einem Anstieg von 8 oxoG und der spontanen Mutationsrate.rnIn dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die basalen Spiegel an oxidativen Basenmodifikationen und die spontanen Mutationsraten in vivo durch die orale Gabe von Resveratrol moduliert werden können. Resveratrol ist ein Pflanzeninhaltsstoff (u.a. aus Rotwein) mit einer Vielzahl von Wirkungen, der bereits in zahlreichen Studien ein chemopräventives Potential gezeigt hat und antioxidativ wirkt.rnAn verschiedenen Mausgenotypen wurden zum einen eine Kurzzeit-Behandlung (7 Tage mit 100 mg/kg per Gavage) und zum anderen eine Langzeit-Behandlung (3-9 Monate mit 0,04% ad libitum) mit Resveratrol durchgeführt. Die oxidativen DNA Schäden wurden in primären Maushepatozyten mit Hilfe einer modifizierten Alkalischen Elution, mit der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA Glykosylase als Sonde, bestimmt. Zur Analyse der Mutationsrate wurde der BigBlue® Mutationsassay mit anschließender Sequenzierung der Mutationen verwendet.rnDie Ergebnisse zeigen, dass die Kurzzeit- und die Langzeit-Behandlung mit Resveratrol die basalen Spiegel oxidativer DNA-Basenmodifikationen senken. Die Reduktion ist jeweils wesentlich ausgeprägter in den reparaturdefizienten Ogg1(-/-)Csb(-/-)-Mäusen zu erkennen. Auch die spontane Mutationsrate wird durch eine mehrmonatige Behandlung mit Resveratrol um ungefähr 20-30% reduziert.rnAnschließende mechanistische Untersuchungen zeigten, dass dieser Schutz wahrscheinlich auf einer Induktion der antioxidativen Schutzmechanismen begründet ist. So wurde gefunden, dass primäre Hepatozyten aus mit Resveratrol behandelten Mäusen wesentlich besser gegen exogen herbeigeführten oxidativen Stress geschützt sind, als Hepatozyten von unbehandelten Tieren. Ein weiterer Hinweis ist die Hochregulation der mRNA-Spiegel von verschiedenen antioxidativen Schutzenzymen, wie Superoxiddismutase 1 / 2, Hämoxygenase 1, Glutathionperoxidase 1, nach der Gabe von Resveratrol in Mäuselebern. Außerdem sind die oxidativen Markermutationen (GC->TA-Transversionen) stärker von der Reduktion der spontanen Mutationsrate betroffen, als andere Mutationen (z.B. GC->AT-Transitionen).rnDie Ergebnisse zeigen erstmalig, dass spontane Mutationen in vivo durch Fremdstoffe in der Nahrung reduziert werden können. Im Falle von Resveratrol wird diese Reduktion wahrscheinlich durch eine Stimulation der antioxidativen Schutzmechanismen ausgelöst.rn

Development and evaluation of a 44 Ti, 44 Sc radionuclide generator and labeling of biomolecules with 44 Sc and 68 Ga for PET imaging

Non-invasive molecular-imaging technologies are playing a key role in drug discovery, development and delivery. Positron Emission Tomography (PET) is such a molecular imaging technology and a powerful tool for the observation of various deceases in vivo. However, it is limited by the availability of vectors with high selectivity to the target and radionuclides with a physical half-life which matches the biological half-life of the observed process. The 68Ge/68Ga radionuclide generator makes the PET-nuclide anywhere available without an on-site cyclotron. Besides the perfect availability 68Ga shows well suited nuclide properties for PET, but it has to be co-ordinated by a chelator to introduce it in a radiopharmaceuticals.rnHowever, the physical half-life of 68Ga (67.7 min) might limit the spectrum of clinical applications of 68Ga-labelled radiodiagnostics. Furthermore, 68Ga-labelled analogues of endoradiotherapeuticals of longer biological half-live such as 90Y- or 177Lu-labeled peptides and proteins cannot be used to determine individual radiation dosimetry directly. rnThus, radionuclide generator systems providing positron emitting daughters of extended physical half-life are of renewed interest. In this context, generator-derived positron emitters with longer physical half-life are needed, such as 72As (T½ = 26 h) from the 72Se/72As generator, or 44Sc (T½ = 3.97 h) from the 44Ti/44Sc generator.rnIn this thesis the implementation of radioactive gallium-68 and scandium-44 for molecular imaging and nuclear medical diagnosis, beginning with chemical separation and purification of 44Ti as a radionuclide mother, investigation of pilot generators with different elution mode, building a prototype generator, development and investigation of post-processing of the generator eluate, its concentration and further purification, the labeling chemistry under different conditions, in vitro and in vivo studies of labeled compounds and, finally, in vivo imaging experiments are described.

Einfluss von Chromatin-Modulatoren auf Bildung, Reparatur und Mutagenität von DNA-Schäden

Die Entstehung von Mutationen, und somit der erste Schritt der Kanzerogenese, steht in engem Zusammenhang mit der Effektivität der DNA-Reparatur. Werden zur Fehlpaarung neigende (prämutagene) DNA-Schäden, wie z.B. die oxidative Läsion 8-oxoG, zu langsam oder auch fehlerhaft repariert, so führt dies zwangsläufig zu einer Erhöhung der Mutationsrate. Das Zusammenspiel zwischen Schadensentstehung und dessen Reparatur ist somit von großem Interesse. Ein wichtiger Faktor, der dieses Gleichgewicht beeinflussen könnte, ist die Chromatinstruktur, die entscheidend ist für die DNA-Zugänglichkeit.rnrnDie Frage, ob und in welchem Ausmaß der globale Kondensationsgrad des Chromatins die Entstehung und Reparatur von DNA-Schäden und damit die Entstehung von Mutationen beeinflusst, war der Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit. Um die Chromatinstruktur zu modulieren, wurden zum einen Resveratrol, zum anderen die HDAC-Inhibitoren Natriumbutyrat und Trichostatin A eingesetzt. Resveratrol führt, möglicherweise über eine SIRT1-Aktivierung, zu einem kondensierten und schlecht zugänglichen Chromatin. Die HDAC-Inhibitoren hingegen resultieren durch verstärkte Acetylierung von Histonen in einer global dekondensierten, offenen Chromatinstruktur. Mit Hilfe des Photosensibilisators Ro19-8022 in Kombination mit sichtbarem Licht, UV-B-Strahlung und Wasserstoffperoxid wurden in so veränderten Zellen verschiedene Arten von DNA-Schäden induziert, welche jeweils spezifisch sind für unterschiedliche Reparaturwege. Das Ausmaß induzierter Läsionen sowie deren Reparatur wurde mittels Alkalischer Elution und entsprechenden Reparaturendonukleasen bestimmt. rnrnDie Ergebnisse zeigen eine durch Resveratrol unbeeinflusste Schadensinduktion, andererseits jedoch eine deutliche Verlangsamung der Reparatur verschiedener Arten von DNA-Läsionen (oxidative Läsionen, Cyclobutanpyrimidindimere, Einzelstrangbrüche) und somit auch verschiedener Reparaturwege in AS52-Zellen. Die HDAC-Inhibitoren hingegen verursachen ein erhöhtes Ausmaß induzierter Läsionen, jedoch keine Änderung der Reparaturgeschwindigkeit. Die Entstehung spontaner und induzierter Mutationen zeigt sich durch Resveratrol unbeeinflusst, HDAC-Inhibitoren resultieren in signifikant erniedrigten Mutationsraten in AS52-Zellen. Letzterer Effekt ist durch die beobachteten Einflüsse auf Reparatur und Suszeptibilität in den Zellen nicht erklärbar und bedarf einer mechanistischen Aufklärung. Die durch Resveratrol beobachtete Reparatur-Retardierung wurde mechanistisch weiter untersucht. Durch Inhibierung von SIRT1, einer durch Resveratrol aktivierten Deacetylase, konnte dessen Beteiligung an der Reparaturverlangsamung ausgeschlossen werden. Auch eine Beteiligung von oxidativem Stress, dem MAPK-Signalweg (ERK 1/2, p38) oder p53 konnte ausgeschlossen werden. Die Durchführung der Reparaturversuche mit menschlichen HeLa-Zellen zeigten, dass die durch Resveratrol verursachten Effekte quantitativ stark zelltypabhängig sind. Während die Reparatur in HeLa-Zellen deutlich weniger beeinflusst wird, sind dennoch andere Parameter wie Proliferation und Glutathionspiegel eher stärker verändert wie in AS52-Zellen. Der Mechanismus der durch Resveratrol verursachten Reparaturhemmung bedarf somit weiterer Untersuchungen.rn

Radiomarkierung von HPMA-basierten, funktionalisierten Polymeren mit metallischen Radionukliden für die medizinische Anwendung als Theranostika

Für eine erfolgreiche Behandlung bösartiger Tumore ist eine frühzeitige Diagnose, aber auch eine effektive und effiziente Therapie essentiell. In diesem Zusammenhang sind Nanomaterialien in den Fokus der Arzneimittelentwicklung gerückt, welche für Diagnostik und Therapie genutzt werden könnten.rnSystematische Studien zur Radiometallmarkierung von Nanopartikeln und deren Stabilität in vitro im Zusammenhang mit der Struktur des Linkers und dem Anteil an Chelator wurden anhand verschiedener HPMA-DOTA-Konjugate durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Linkerstruktur und der Belegungsgrad sowohl die Markierung als auch die in vitro -Stabilität von radiometallmarkierten HPMA-rnDOTA-Konjugaten beeinflussen.rnFür die Markierung selbst stehen mehrere Generator-produzierte metallische Positronenemitter zur Verfügung. Infolge der gesetzlichen Bestimmungen muss das Eluat der Generatoren bestimmte Spezifikationen (Elutionsausbeute, Durchbruch des Mutternuklids, Gehalt an Fremdionen, pH-Wert etc.) erfüllen, um für die Darstellung von Radiopharmaka verwendet werden zu können.rnFür das bereits etablierte PET-Nuklid 68Ga konnte eine Ethanol-basierte Aufreinigung entwickelt werden, welche hohe Elutions- und Markierungsausbeuten sowie Radionuklidreinheit garantiert und damit einen wichtigen Schritt für die Entwicklung von Kit-Formulierungen repräsentiert. Ausserdem konnten zwei Methoden zur Qualitätskontrolle entwickelt werden, welche es ermöglichen die Radionuklidreinheit des initialen 68Ga-Eluats, aber auch des finalen 68Ga-Radiopharmakons innerhalb einer Stunde ohne γ–Spektroskopie zu bestimmen.rnWährend mit 68Ga die Pharmakokinetik markierter Derivate für einen Zeitraum von bis 3 Stunden zugänglich ist, deckt das Generator-produzierte 44Sc eine Periode von bis zu einem Tag ab. Damit lässt sich die Pharmakokinetik markierter polymerer Drug Carrier-Systeme – von der frühen Ausscheidungsphase bis hin zu organspezifischen Akkumulationen durch passives und aktives Targeting – gut beschreiben.rnFür 44Sc konnte anhand der Modellverbindung DOTATOC gezeigt werden, dass das aufgereinigte Generatoreluat für die Markierung mit hohen radiochemischen Ausbeuten geeignet ist und etablierte Markierungsmethoden übertragbar sind. In weiterführenden Studien zur molekularen Bildgebung könnte das Potential dieses PET-Nuklids für die Langzeitbildgebung gezeigt werden.

Untersuchung der DNA-Reparatur in humanen Lymphozyten

Oxidative DNA-Schäden, wie 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), werden kontinuierlich in allen Zellen durch endogene und exogene Noxen gebildet. Ohne eine effektive Reparatur können DNA-Schäden nach erfolgter Replikation als Mutationen fixiert werden und somit die Kanzerogenese initiieren.rnUntersuchungsgegenstand dieser Arbeit war die Reparatur, vorrangig von oxidativen DNA-Schäden, in humanen Lymphozyten. Dabei sollte ebenfalls überprüft werden, inwiefern eine Aktivierung dieser Immunzellen, die u.a. zu einer Initiierung der Proliferation führt, modulierend auf die DNA-Reparatur wirkt. Für diese Untersuchungen wurden primäre Lymphozyten aus Buffy Coats isoliert. Eine Aktivierung von T Lymphozyten, welche physiologisch Antigen-vermittelt über den T-Zell-Rezeptor verläuft, wurde durch eine ex vivo Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) nachgeahmt. Die Induktion oxidativer DNA-Basenmodifikationen erfolgte mit Hilfe des Photosensibilisators Acridinorange in Kombination mit sichtbarem Licht. Das Schadensausmaß sowie die Reparatur wurden mittels der Alkalischen Elution unter Nutzung der Reparaturendonuklease Fpg bestimmt.rnDie Ergebnisse zeigten, dass global keine Reparatur induzierter oxidativer DNA-Schäden in primären Lymphozyten stattfindet. Eine Aktivierung der Lymphozyten mittels PHA führte hingegen zu einer deutlichen Reduktion der induzierten DNA-Schäden innerhalb einer 24-stündigen Reparaturzeit. Diese verbesserte Reparatur konnte auf eine Steigerung der Transkription und somit eine erhöhte Proteinmenge von OGG1, welches die Reparatur von 8-oxoG DNA-Glykosylase initiiert, zurückgeführt werden. Weiterführende mechanistische Untersuchungen deuten darauf hin, dass der transkriptionellen Regulation von OGG1 eine Aktivierung der JNK-Signalkaskade zugrunde liegt. Als ein verantwortlicher Transkriptionsfaktor konnte NF-YA identifiziert werden. Dessen erhöhte Bindung am OGG1-Promotor in Folge einer PHA-Stimulation konnte durch eine JNK-Hemmung reduziert werden.rnDie Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Aktivierung von Lymphozyten, welche die Proliferation initiiert und dadurch mit dem Risiko für die Entstehung von Mutationen und malignen Entartungen verknüpft ist, gleichzeitig eine transkriptionelle Hochregulation von OGG1 bewirkt, die die Reparatur oxidativer DNA-Schäden sicherstellt. Die Fähigkeit zur Steigerung der DNA-Reparatur unter den gezeigten Bedingungen bietet den proliferierenden Zellen einen Schutzmechanismus zur Erhaltung ihrer genomischen Stabilität.rn

Untersuchung der Rolle reaktiver Sauerstoffspezies und DNA-Schäden bei Hypertonie und Arteriosklerose

Angiotensin II induziert intrazellulär die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, welche DNA-Schäden erzeugen können. Um die Hypothese zu prüfen, dass durch Angiotensin II induzierte DNA-Schäden für die erhöhte Krebsinzidenz hypertensiver Menschen verantwortlich sind, wurde eine vierwöchige Behandlung von Mäusen mit Angiotensin II (0,6 μg/kg/min) durchgeführt. Mit der Alkalischen Elution wurden in Zellen aus verschiedenen Organen der Mäuse die Menge an DNA-Einzelstrangbrüchen und oxidativen DNA-Modifikationen bestimmt. In der Niere wurde außerdem mit dem BigBlue® Mutations-Assay die Entstehung von Mutationen analysiert. In keinem der analysierten Organe konnte eine Erhöhung der DNA-Schäden oder eine Erhöhung der Mutationsfrequenzen durch die Angiotensin II-Behandlung nachgewiesen werden. Die durchgeführten Untersuchungen geben somit keinen Hinweis auf eine DNA-schädigende und mutagene Wirkung von Angiotensin II.rnBei der Entstehung und dem Krankheitsverlauf von Arteriosklerose spielen reaktive Sauerstoffspezies ebenfalls eine noch nicht genau geklärte Rolle. Um zu ermitteln, ob oxidative DNA-Schäden die Entstehung der Arteriosklerose begünstigen, wurde die Endothelfunktion von Wildtyp- und reparaturdefizienten Ogg1-/--Mäusen verglichen. Entgegen der Vermutung, dass oxidative DNA-Modifikationen die Endothelfunktion verschlechtern, zeigen die Untersuchungen, dass Ogg1-/--Mäuse, die höhere Spiegel an oxidativen DNA-Modifikationen in ihrem Genom haben, eine signifikant bessere Endothelfunktion besitzen als Wildtyptiere. Dieser Befund weist auf eine neuartige, von der DNA-Reparatur unabhängige Funktion von OGG1 hin.rn

Untersuchung zur endogenen Bildung von oxidativen DNA-Schäden in vivo und in vitro

In dieser Arbeit sollte der Einfluss einer Überproduktion von humaner Superoxiddismutase 1 (hSOD1) auf die Spiegel der DNA-Schäden in verschiedenen Geweben von transgenen Mäusen untersucht werden. Tiere die eine Defizienz des Ogg1- und Csb- Proteins aufweisen und deshalb oxidative Purinmodifikationen nicht oder nur schwer reparieren können, akkumulieren 8-oxoG im Laufe ihres Lebens (Osterod, et al. 2001). Aus diesem Grund sind diese ein gutes Modell, um protektive Eigenschaften von Antioxidantien wie z.B. Substanzen oder Enzymen zu untersuchen. Fusser, et al. 2011 konnten beispielsweise zeigen, dass das pflanzliche Polyphenol Resveratrol die endogenen Spiegel an 8-oxoG sowie die spontanen Mutatiosraten im Lac I - Gen senken kann. Um den Einfluss von hSOD1 in vivo zu untersuchen, wurden in zwei Zuchtschritten 4 Mausgenotypen generiert, nämlich (Csb -/- Ogg1 -/- und Csb +/- Ogg1 +/- Mäuse jeweils mit ohne hSOD1 Überexpression). Diese wurden in verschiedenen Altersstufen auf die Basalspiegel an oxidativen Schäden (Einzelstrangbrüche und Fpg-sensitive Läsionen) in der Leber, der Niere und der Milz untersucht. Die Genotypen wurden zunächst charakterisiert und die hSOD1-Überexpression mittels qRT-PCR, Western Blot und Enzymaktivitätsbestimmung verifiziert. Es konnte an diesen Tieren erstmalig gezeigt werden, dass SOD die Generierung von DNA-Schäden in vivo mit zunehmendem Alter der Tiere senkt und dass deshalb Superoxid eine der reaktiven Sauerstoffspezies ist, die unter physiologischen Bedingungen für die DNA-Schäden verantwortlich ist. Außerdem kann ein möglicher toxischer Effekt der Überproduktion von SOD ausgeschlossen werden. Erhöhte Spiegel an oxidativen DNA-Schäden durch womöglich erhöhte Spiegel an H2O2 konnten in dieser Studie nicht beobachtet werden. Eine Messung der Genexpression anderer antioxidativer Enzyme wie Katalase, SOD2 und SOD3, GPX oder HO1 sind an diesem Effekt nicht beteiligt. Auch konnte kein Einfluss des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors Nrf2 gezeigt werden. rnUm mögliche Quellen der für die oxidativ gebildeten DNA-Schäden verantwortlichen ROS zu identifizieren, wurde der Einfluss des Dopaminstoffwechsels untersucht. Während des Dopaminmetabolismus werden intrazellulär Reaktive Sauerstoffspezies (H2O2 und O2.-) gebildet und tragen sehr wahrscheinlich zur Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson bei. In dem gängigen Parkinson-Zellkulturmodell SH-SY5Y konnte keine Erhöhung von oxidativen Schäden in nukleärer DNA nach Dopaminbehandlung nachgewiesen werden. Eine Überexpression der Dopaminmetabolisierenden Enzyme MAO-A und MAO-B zeigen bei niedrigen Dosen Dopamin eine leichte jedoch nicht signifikante Erhöhung der Fpg-sensitiven Modifikationen. Die Überproduktion des Dopamintransporters zeigte keinen Effekt nach Dopaminzugabe. Es kann geschlussfolgert werden, dass durch erhöhte MAO-A und MAO-B endogen ROS gebildet werden, die die Bildung Fpg-sensitiver Läsionen hervorrufen. Bei hohen Dosen und langer Inkubationszeit steht die Dopaminautoxidation, anschließende Neuromelaninbildung und als Konsequenz Apoptose im Vordergrund.rn