Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorgänge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalität vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch γ-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Domänen, die an der Proteinoberfläche exponiert werden, könnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der γ-A und γ-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv des γ-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den grünen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen Lücke weitere Organismen hinsichtlich des γ-A und γ-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Geißeln. Des weiteren wurde mit verschiedenen γ-Tubulin-Konstrukten um das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des γ-A- und γ-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angehören, nur im γ-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die Möglichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des γ-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als Köder-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-ähnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des γ-Tubulins hin. Zur Aufklärung müsste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen über Interaktionen der Cytoskelettkomponenten können wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgeklärt werden.

Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine des Abwehrsystems der Porifera - ein Apoptoseregulator und ein antimikrobielles Protein aus dem Schwamm Suberites domuncula

Aufgrund ihrer Lebensweise und -umgebung sind effiziente Strategien zur Abwehr bedrohender Einflüsse essentiell für die Porifera. Eine dieser Strategien stellen die Apoptose in höheren Metazoen, sowie ein effizientes Immunsystem dar. Diese sichern sowohl das Überleben des Organismus als auch die Entfernung beschädigter, infizierter oder redundanter Zellen. Bei Untersuchungen der Porifera auf Moleküle, die an diesen Prozessen beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren beachtliche Erfolge erzielt werden. So konnten das in der Apoptose involvierte Protein GCDD2 (proapoptotisch), die antiapoptotischen GCBHP1 und GCBHP2 Proteine (Wiens et al., 2001), sowie ein LPS induzierbarer TNF (Wiens et al., 2007) und zwei Caspasen (Wiens et al., 2003) in Schwämmen identifiziert werden. Um diese essentiellen Mechanismen besser verstehen zu können, sollte ein möglicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor identifiziert werden. Hierzu wurde die SpongeBase Datenbank nach Proteinen mit Todesdomänen durchsucht und diese unter Anwendung von PCR- und Screening-Techniken in einer cDNA-Bank des marinen Schwammes S. domuncula komplettiert. Im Anschluss an ihre Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, dessen Todesdomäne größte Homologie zu einem TNFR zeigte. Dieser Klon SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologes Protein) wurde anschließend diversen Sequenz- und Strukturanalysen unterzogen. Diese offenbarten die Existenz zweier funktional bedeutsamer Domänen (Ubiquitin-like und Todesdomäne). Vor allem die Todesdomäne impliziert eine Beteiligung des Proteins an apoptotischen Prozessen. Über einen „Yeast Two Hybrid Screen“ sollten Proteine identifiziert werden, welche mit dem Ausgangsprotein interagieren. Hierbei wurde ein Protein identifiziert, das Ähnlichkeit mit einem antimikrobiellen Peptid aufweist. Dieses Protein kann analog zu einer Gruppe von antimikrobiellen Peptiden, den α-helikalen kationischen Peptiden, in drei Teile gespalten werden. Das Signalpeptid sowie ein anionisches Propeptid werden abgespalten und es entsteht ein kationisches, antimykotisch wirksames Peptid. Beide Proteine sollten, sofern sie in die Abwehrreaktionen involviert sind, durch Inkubation mit mikrobiellen Strukturen vermehrt exprimiert werden. Eine Überprüfung der Transkription mittels Northern Blot Analysen bestätigte dies für das SD_TNFR-like nach Inkubation mit LPS und TNF- α sowie für SD_Brevinin-like nach Inkubation mit LPS, PAM und Hefe. Mit der Herstellung eines rekombinanten SD_TNFR-like-Proteins wurde die Immunisierung von Kaninchen und die folgende Gewinnung eines polyklonalen SD_TNFR-like-Antikörpers ermöglicht. Dieser gestattete den Nachweis der SD_TNFR-like -Expression mittels Western Blot-Analysen sowie die stressinduzierte erhöhte Expression mittels Dot Blot-Analysen auch auf Proteinebene. Um die Funktion des SD_TNFR-like Proteins zu charakterisierten, wurde ein Test mit RAW-Blue™-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse implizieren, dass das Protein Teil der Immunreaktion analog der der TLR- bzw. NLR- Reaktion ist. Auch die Interaktion mit einem antimikrobiellen Protein, welches für das Überleben des Organismus und die Bekämpfung der Mikroorganismen sorgt, deutet auf eine solche Beteiligung hin. Zusätzlich wird diese These durch ein Ergebnis der Strukturanalysen unterstützt, nämlich die Identifizierung einer TRAF2 Bindestelle. TRAF2 ist ein Adapterprotein der TNFR und aktiviert Überlebensfaktoren über den NF - B-Weg. Immunohistochemische Analysen zeigten, dass das SD_TNFR-like Protein im Organismus vor allem um die Bakteriozysten, um verschiedene Mikroorganismen und am Rand des Schwammes exprimiert wird, was ebenfalls für eine immunologische Funktionsweise spricht. Auch im restlichen Gewebe wird es kontinuierlich, auch ohne vorherige LPS Inkubation exprimiert. Diese Akkumulation zeigt deutlich, dass das Protein in einen Schutzmechanismus gegen äußere Bedrohungen involviert ist. Es scheint dabei direkt an den eindringenden Mikroorganismen zu wirken. Das SD_TNFR-like ist demnach ein potentieller Bestandteil der Immunantwort des Schwammes, welches Apoptose verhindern und Überlebensmechanismen aktivieren kann. Das SD_Brevinin-like Protein besitzt antimykotische Aktivität, wie in einem antimikrobiellen Test gezeigt werden konnte. Weiterhin scheint es für das SD_TNFR-like Protein als positiver bzw. negativer Regulator von Bedeutung zu sein, der eine Reaktion entweder beendet oder die Expression von Überlebensfaktoren verstärkt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen demonstrieren somit die Identifizierung eines neuen Schwammproteins, welches eine Rolle in der Immunantwort spielt, sowie eines neuen antimikrobiellen Peptids, welches die Wirkung des TNFR-like moduliert. Es müssen jedoch noch weitere Funktionsanalysen folgen, um den Mechanismus des SD_TNFR-like Proteins und seine Regulation genauer charakterisieren zu können