Regulation und funktionelle Bedeutung der zellulären und humoralen Immunantwort in der Pathogenese der chronischen Hepatitis C Virusinfektion

Patienten mit akuter, selbstlimitierender HCV-Infektion und solche mit IFN-a Therapieresponse (SCR) zeigten eine hochregulierte NS3-spezifische T-Helferzellantwort.Über die funktionelle Bedeutung der T-Helferzellantwort und der Antikörpersynthese besteht jedoch noch Unklarheit.In dieser Studie wurde die proliferative Antwort der PBMC von Patienten mit anhaltender Therapieresponse (SCR; n=8), Non-Respondern (NR; n=13) und unbehandelten HCV-Patienten(UTR; n=10) sowie gesunden Kontrollen (HC; n=5) auf die rekombinanten HCV-Antigene Core, Helicase, NS3, NS4 und NS5-4 bestimmt und ihre Sekretion von IFN-.

Klonierung und Charakterisierung eines Konsensusgenoms des Hepatitis C Virus als Grundlage der Etablierung eines Zellkultursystems

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist der Haupterreger der parenteral übertragenen non-A non-B Hepatitis. Bisher wurde die Erforschung der Replikation und Pathogenese des HCV durch das Fehlen eines effizienten und verläßlichen Zellkultursystems behindert.Virale RNA aus infizierten humanen Leberzellen wurde isoliert und kloniert. Mit Hilfe eines Vergleichs mehrerer Klone wurde eine isolatspezifische Konsensussequenz bestimmt, auf deren Basis ein Konsensusgenom konstruiert wurde. Mit dem Konsensusgenom als Grundlage wurden subgenomische RNA-Moleküle, sogenannte „selektionierbare Replikons“ hergestellt. Nach Transfektion der Replikons in humane HuH-7 Hepatoma-Zellen konnte gezeigt werden, daß die Replikons autonom und in hohem Maße in den Wirtszellen replizierten.Die Arbeit definiert die Struktur von HCV-Replikons, die in Zellkultur funktionell sind. Damit wird die Basis für ein lange gesuchtes HCV-Zellkultursystem geschaffen, welches das Studium der HCV-Replikation im Detail und die Entwicklung antiviral wirksamer Substanzen ermöglicht.

Structural and functional analysis of the hepatitis C virus non-structural protein 5A

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA Virus aus der Familie der Flaviviridae. Sein Genom kodiert für ein ca. 3000 Aminosäuren langes Polyprotein, welches co- und posttranslational in seine funktionellen Einheiten gespalten wird. Eines dieser viralen Proteine ist NS5A. Es handelt sich hierbei um ein stark phosphoryliertes Protein, das eine amphipatische α-Helix im Amino-Terminus trägt, welche für die Membran-Assoziation von NS5A verantwortlich ist. Welche Rolle die Phosphorylierung für die Funktion des Proteins spielt, bzw. welche Funktion NS5A überhaupt ausübt, ist zur Zeit noch unklar. Beobachtungen lassen Vermutungen über eine Funktion von NS5A bei der Resistenz infizierter Zellen gegenüber Interferon-alpha zu. Weiterhin wird vermutet, das NS5A als Komponente des membranständigen HCV Replikasekomplexes an der RNA Replikation beteiligt ist. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Funktion von NS5A für die RNA Replikation zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine Serie von Phosphorylierungsstellen-Mutanten generiert, die auf Ihre Replikationsfähigkeit und den Phosphorylierungsstatus hin untersucht wurden. Wir fanden, dass bestimmte Serin-Substitutionen im Zentrum von NS5A zu einer gesteigerten RNA Replikation führten, bei gleichzeitig reduzierter NS5A Hyperphosphorylierung. Weiterhin studierten wir den Einfluß von Mutationen in der Amino-terminalen amphipatischen α-Helix von NS5A auf die RNA-Replikation, sowie Phosphorylierung und subzelluläre Lokalisation des Proteins. Wir fanden, dass geringfügige strukturelle Veränderungen der amphipatischen Helix zu einer veränderten subzellulären Lokalisation von NS5A führten, was mit einer reduzierten oder komplett inhibierten RNA Replikation einherging. Zudem interferierten die strukturellen Veränderungen mit der Hyperphosphorylierung des Proteins, was den Schluß nahe legt, dass die amphipatische Helix eine wichtige strukturelle Komponente des Proteins darstellt, die für die korrekte Faltung und Phosphorylierung des Proteins essentiell ist. Als weitere Aspekte wurden die Trans-Komplementationsfähigkeit der verschiedenen viralen Komponenten des HCV Replikasekomplexes untersucht, sowie zelluläre Interaktionspartner von NS5A identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass NS5A eine wichtige Rolle bei der RNA-Replikation spielt. Diese Funktion wird wahrscheinlich über den Phosphorylierungszustand des Proteins reguliert.

RNA-Strukturen im Hepatitis-C-Virus und ihre Bedeutung für Translation und Replikation

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt ein Plusstrang-RNA Genom von ca. 9600 Nukleotiden Länge, das nur ein kodierendes Leseraster besitzt. Das Genom wird am 5’ und 3’ Ende von nicht-translatierten Sequenzen (NTRs) flankiert, welche für die Translation und vermutlich auch Replikation von Bedeutung sind. Die 5’ NTR besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die eine cap-unabhängige Translation des ca. 3000 Aminosäure langen viralen Polyproteins erlaubt. Dieses wird ko- und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in 10 funktionelle Komponenten gespalten. Inwieweit die 5’ NTR auch für die Replikation der HCV RNA benötigt wird, war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Die 3’ NTR besitzt eine dreigeteilte Struktur, bestehend aus einer variablen Region, dem polyU/UC-Bereich und der sogenannten X-Sequenz, eine hochkonservierte 98 Nukleotide lange Region, die vermutlich für die RNA-Replikation und möglicherweise auch für die Translation benötigt wird. Die genuae Rolle der 3’ NTR für diese beiden Prozesse war zu Beginn der Arbeit jedoch nicht bekannt. Ziel der Dissertation war deshalb eine detaillierte genetische Untersuchung der NTRs hinsichtlich ihrer Bedeutung für die RNA-Translation und -Replikation. In die Analyse mit einbezogen wurden auch RNA-Strukturen innerhalb der kodierenden Region, die zwischen verschiedenen HCV-Genotypen hoch konserviert sind und die mit verschiedenen computer-basierten Modellen vorhergesagt wurden. Zur Kartierung der für RNA-Replikation benötigten Minimallänge der 5’ NTR wurde eine Reihe von Chimären hergestellt, in denen unterschiedlich lange Bereiche der HCV 5’ NTR 3’ terminal mit der IRES des Poliovirus fusioniert wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass die ersten 120 Nukleotide der HCV 5’ NTR als Minimaldomäne für Replikation ausreichen. Weiterhin ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Länge der HCV 5’ NTR und der Replikationseffizienz. Mit steigender Länge der 5’ NTR nahm auch die Replikationseffizienz zu, die dann maximal war, wenn das vollständige 5’ Element mit der Poliovirus-IRES fusioniert wurde. Die hier gefundene Kopplung von Translation und Replikation in der HCV 5’ NTR könnte auf einen Mechanismus zur Regulation beider Funktionen hindeuten. Es konnte allerdings noch nicht geklärt werden, welche Bereiche innerhalb der Grenzen des IRES-Elements genau für die RNA-Replikation benötigt werden. Untersuchungen im Bereich der 3’ NTR ergaben, dass die variable Region für die Replikation entbehrlich, die X-Sequenz jedoch essentiell ist. Der polyU/UC-Bereich musste eine Länge von mindestens 11-30 Uridinen besitzen, wobei maximale Replikation ab einer Länge von 30-50 Uridinen beobachtet wurde. Die Addition von heterologen Sequenzen an das 3’ Ende der HCV-RNA führte zu einer starken Reduktion der Replikation. In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte keines der Elemente in der 3’ NTR einen signifikanten Einfluss auf die Translation. Ein weiteres cis aktives RNA-Element wurde im 3’ kodierenden Bereich für das NS5B Protein beschrieben. Wir fanden, dass Veränderungen dieser Struktur durch stille Punktmutationen die Replikation hemmten, welche durch die Insertion einer intakten Version dieses RNA-Elements in die variable Region der 3’ NTR wieder hergestellt werden konnte. Dieser Versuchsansatz erlaubte die genaue Untersuchung der für die Replikation kritischen Strukturelemente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Struktur und die Primärsequenz der Loopbereiche essentiell sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzkomplementarität zwischen dem Element in der NS5B-kodierenden Region und einem RNA-Bereich in der X-Sequenz der 3’ NTR gefunden, die eine sog. „kissing loop“ Interaktion eingehen kann. Mit Hilfe von gezielten Mutationen konnten wir zeigen, dass diese RNA:RNA Interaktion zumindest transient stattfindet und für die Replikation des HCV essentiell ist.

Analyse von Pathomechanismen im Rahmen der Hepatitis-C-Infektion

Das Hepatitis C Virus stellt mit weltweit 170 Millionen infizierten Menschen ein großes gesundheitliches Problem dar. Zwar sind in den letzten Jahren deutliche Fortschritte in der Behandlung der Hepatitis C gemacht worden, gleichwohl ist die Hepatitis C durch das Fehlen eines potenten Impfstoffes weiterhin ein relevantes gesundheitliches Risiko, da sich Infektionsraten auf diesem Wege nicht eindämmen lassen. Der Ansatz dieser Dissertation bestand in der Konstruktion adenoviraler Vektoren, die Anteile des HCV-Genoms beinhalten. Mit Hilfe dieser Vektoren sollten verschiedene Zelltypen transduziert werden, eine Überexpression viraler Proteine initiert werden und Effekte der HCV Proteine HCV-Core und HCV-NS5a ermittelt werden. Diese Dissertationsschrift beschreibt die Konstruktion der adenoviralen Vektoren, die die Hepatitis Gene Core bzw. NS5a tragen. Die Klonierungsschritte werden umfassend aufgezeigt. Darauf aufbauend werden Versuche gezeigt, die die erfolgreiche adenovirale Transduktion in Zielzellen bestätigen. Es werden phänotypische Veränderungen der verschiedenen Zielzellen anhand mikroskopischer Aufnahmen demonstriert. Zusätzlich wird die erfolgreiche Konstruktion der Vektoren durch Detektion der viralen Proteine im Western Blot bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass sich verschiedene Zielzellen mit den Vektoren transduzieren lassen und die Proteinexpression der HCV-Proteine einer dosisabhänigen Expressionskinetik folgt. In weiteren Untersuchungen konnten Veränderungen der Viabilität der Zellen durch die Expression der viralen Proteine HCV-Core und HCV-NS5a gezeigt werden. Durch eine dosisabhängige Herunterregulation des anti-apoptoischen Proteins MCL-1 ist das Gesamtüberleben der Zellen vermindert. Die Wachstumskinetik der transduzierten Zellen ist signifikant herabgesetzt.

Analyse genomischer Imbalancen in hepatozellulären Karzinomen und präneoplastischen Leberläsionen

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist mit ungefähr 1,000,000 neuen Fällen pro Jahr einer der häufigsten malignen Tumore weltweit. Es ist hauptsächlich in Südost-Asien und im südlichen Afrika verbreitet. Risikofaktoren sind chronische Infektionen mit Hepatitis Viren (HBV, HCV), Aflatoxin B1-Belastung und chronischer Alkoholkonsum. Um Veränderungen auf genomischer Ebene in HCCs zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Untersuchung Frischgewebeproben von 21 Patienten mit HCCs und formalin-fixiertes, paraffineingebettetes Material von 6 Dysplastischen Knoten mittels Comparativer genomischer Hybridisierung (CGH) analysiert. In den untersuchten HCCs konnte Zugewinne auf 1q (12/21), 6p ( 6/21), 8q (11/21), 17q (6/21), 20q (6/21), sowie Verluste auf 4q (7/21), 6q (4/21), 10q (3/21), 13q (4/21), 16q (3/21) identifiziert werden. Die Validität der mit diesem Ansatz erzielten Ergebnisse konnte anhand von unabhängigen Kontrollexperimenten mit Interphase-FISH-Analyse nachgewiesen werden. Die in Dysplastische Knoten identifizierten Veränderungen sind Gewinne auf 1q (50% ) sowie Verluste auf 8p und 17p. Daher stellt 1q eine Kandidatenregion für die Identifizierung jener Gene dar, die bereits im frühem Stadium der Hepatokarzinogenese aktiviert sind. Die Gen-Expressionsanalyse eines HCCs mit Gewinnen auf 1q, 8q, und Xq zeigte die Überexpression von einigen Genen, die in den amplifizierten Regionen liegen. Daher kann spekuliert werden, dass die DNA-Amplifikation in der Hepatokarzinogenese bei einigen Genen ein Mechanismus der Aktivierung sein kann. Zusammengefasst konnte somit durch CGH-Analyse charakteristische, genomische Imbalances des HCC ermittelt werden. Der Vergleich mit Veränderungen bei prämalignen Läsionen erlaubt die Unterscheidung früher (prämaligner) und später (progressionsassoziierter) Veränderungen

Leberregeneration bei fortgeschrittener Leberzirrhose : Untersuchung Albumin-exprimierender Gallengangsproliferate mittels In-situ-Hybridisierung

Die Leber besitzt das Potential nach verursachter Zellschädigung durch chemische, toxische, traumatische oder virale Einwirkung (55, 73, 79, 95) sich selbst zu regenerieren. Dies geschieht entweder durch Hyperplasie der Hepatozyten, d.h. einer Volumenzunahme durch vermehrte Zellteilung und Erhöhung der Zellzahl (73, 79). Bei massiver und chronischer Leberzellschädigung, wie z.B. alkohol-verursachter Leberzirrhose oder durch chronisch virale Hepatitis (55, 74, 81) können die Hepatozyten den entstandenen Defekt nicht kompensieren und die oval cells, Bezeichnung im Rahmen der Nagetiermodelle, werden aktiviert (98, 105). Das humane Equivalent zu den oval cells bei Nagetieren stellen die hepatischen Progenitorzellen dar (79), diese sind in den Hering-Kanälchen lokalisiert (1, 42, 49). Aufgrund ihrer bipotenten Differenzierungsfähigkeit, können aus den hepatischen Progenitorzellen sowohl Hepatozyten als auch Cholangiozyten hervorgehen (18, 45). rnFür die Untersuchungen einer positiven Albumin-mRNA-Expression in Gallengangsproliferaten bei menschlichen zirrhotischen Leberpräparaten, die im Rahmen der Leberregeneration aus hepatischen Progenitorzellen entstehen, bietet sich das bereits etablierte Verfahren der Albumin mRNA in situ Hybridisierung an. Zur Durchführung der Methode wurde ein bereits etabliertes Protokoll zur in situ Hybridiserung von mRNAs peroxisomaler Proteine verwendet (86, 87).rnDas Patientenkollektiv bestand aus insgesamt 50 Patienten (9 weiblichen und 41 männlichen), im Alter von 40 bis 69 Jahren (Median=53, 25 %-Perzentile=49, 75%-Perzentile=60). Sieben Patienten zeigten eine Leberzirrhose auf dem Boden einer Hepatitis B, 24 Patienten eine Leberzirrhose auf dem Boden einer Hepatitis C und 19 Patienten waren an einer äthyltoxisch-bedingten Leberzirrhose erkrankt. Zusätzlich wurde bei insgesamt 23 Patienten im Rahmen der histologischen Befundung ein Hepatozelluläres Karzinom (HCC) diagnostiziert. rnMikroskopisch zeigte sich in 48 von 50 Präparaten eine Gallengangsproliferation innerhalb der bindegewebigen Septen. Bei Vorliegen einer Gallengangsproliferation wurde deren Ausprägung in 4 Grade (0=keine, 1=wenig, 2=mäßig und 3=stark) eingeteilt. Ein möglicher signifikanter Unterschied, ob der Grad einer Gallengangsproliferation auf eine bestimmte Ursache der Leberzirrhose zurück zu führen ist, ließ sich mit einem p-Wert von 0,247 nicht eruieren. Ebenso wie die Gallengansproliferation wurde die Albuminexpression in Grade eingeteilt. Dabei wurde zwischen keiner (Grad 0), einer intermediären (Grad 1) und einer starken (Grad 2) Albuminexpression unterschieden. Hier waren mit einem p-Wert von 0,586 keine Unterschiede zwischen der Gradeinteilung der Albuminexpression und den 3 Gruppen zu erkennen.rnZwischen den Präparaten mit einem HCC und ohne HCC ergaben sich hinsichtlich des Grades der Gallengangsproliferation mit einem p-Wert von 0,803 keine signifikanten Unterschiede. In Bezug auf die Gradeinteilung der Albuminexpressionrnzeigte sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied mit einem p-Wert von 0,275 zwischen Präparaten mit und ohne Nachweis eines HCCs. Ebenfalls zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen der Gallengangsproliferation (p-Wert von 0,709) und Albuminexpression (p-Wert von 0,613) zwischen Patienten jünger und älter als 60 Jahre.rnDie Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass mittels der in situ Hybridisierung ein Nachweis der Gallengangsproliferation in leberzirrhotischen Präparaten unterschiedlicher Ätiologien gelingt. Zudem kann diese Arbeit beweisen, dass die Gallengangsproliferate Albumin exprimieren und dass der Nachweis dieser Albuminexpression mittels in situ Hybridisierung möglich ist. Allerdings zeigte sich kein signifikanter Unterschied der Albumin-mRNA-Expression in den Gallengangsproliferaten zwischen den unterschiedlichen Ätiologien der Leberzirrhose und ebenfalls nicht im Vergleich von Leberzirrhosen unterschiedlicher Genese mit und ohne gleichzeitigem Nachweis eines HCCs. rn

Untersuchungen über Wechselwirkungen zwischen Proteinen der Leber und dem großen Hüllprotein des Hepatitis-B-Virus

Zusammenfassung:Im Infektionszyklus des Hepatitis-B-Virus spielt das große L-Hüllprotein mit seiner einzigartigen PräS1-Domäne eine zentrale Rolle. Es vermittelt die Bindung und Aufnahme in die Leberzelle, die Verpackung der Nukleokapside in die Virushülle, die Regulation der cccDNA-Amplifikation und eine transkriptionelle Aktivierung in der Wirtszelle. Zur Erfüllung seiner vielfältigen Aufgaben benötigt das L-Protein Unterstützung durch Wirtzellfaktoren, von denen einige im Rahmen dieser Untersuchung durch Verwendung von PräS1-Konstrukten als Fängerproteine im Hefe-Zwei-Hybrid-System identifiziert wurden. Mehrere Klone, die im Hefe-Zwei-Hybrid-Test mit dem C-terminalen PräS1-Fängerprotein (Aminosäure 44-108) isoliert worden waren, enthielten Teile der cDNA von gamma2-Adaptin, einem mutmaßlichen Mitglied der Clathrin-Adaptor-Proteine. Diese sind für intrazelluläre Membrantransportprozesse mittels clathrinumhüllter Vesikel verantwortlich. Unter den interagierenden Klonen, die mit dem N-terminalen Konstrukt des L-Proteins (Aminosäure 1-70) isoliert worden waren, befand sich überproportional häufig eine cDNA, die der schweren Kette H4 der Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitor-Familie homolog war. H4 besitzt vermutlich bei der 'Akute-Phase-Reaktion', die Entzündungen folgt, und bei der Stabilisierung der extrazellulären Matrix physiologische Bedeutung. Weitere Klone kodierten für die Serinprotease C1r. Diese ist Bestandteil des C1-Komplex, der ersten Komponente des klassischen Komplementsystems. Die Spezifität der Bindung zwischen den positiven Klonen und der PräS1-Domäne wurde in weiteren biochemischen Interaktionstests bestätigt, sodaß H4, C1r und gamma2-Adaptin als Wirtszellfaktoren in der Physiologie des Hepatitis-B-Virus wahrscheinlich eine Rolle spielen.Abstract:Little is known about host cell factors necessary for hepatitis B virus assembly and infectivity. Central to virogenesis is the large L envelope protein that mediates hepatocyte receptor binding, envelopment of viral capsids, regulation of supercoiled DNA amplification and transcriptional transactivation. To assess its multiple functions and host-protein assistance involved, we here initiated a yeast two-hybrid screen using the L-specific preS1 domain as bait to screen a human liver cDNA library for L-interacting proteins. One of the most prominent cDNAs interacting with aminoacid sequence 44-108 of L-protein encodes for gamma2-adaptin, a novel clathrin adaptor-related protein responsible for protein sorting and trafficking. Among the clones interacting with the N-terminal construct of L-protein (aminoacid sequence 1-70), a frequently isolated cDNA corresponds to the gene for inter-alpha-trypsin family heavy chain H4, likely to be involved in acute inflammatory phase response and stabilization of extracellular matrices. Some other interacting clones were found to carry the cDNA for the serine protease C1r, a subunit of the C1 complex which initiates the classical complement cascade. The specificity of the interaction between the positive clones and the preS1 domain was further confirmed in independent biochemical experiments. Taken together, the results suggest a role for H4, C1r and gamma2-adaptin as host-cell factors in L-mediated process of viral biogenesis and/or pathogenesis.

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse model

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse modelrnRaja Vuyyuru and Wulf O. BöcherrnHepatitis B is a liver disease caused by Hepatitis B virus (HBV). It ranges in severity from a mild illness, lasting a few weeks (acute), to a serious long-term (chronic) illness that can lead either to liver disease or liver cancer. Acute infection is self limiting in most adults, resulting in clearance of virus from blood and liver and the development of lasting immunity. However 5% of acutely infected patients do not resolve primary HBV infection, leading to chronic infection with persistent viral replication in the liver. The strength of the initial antiviral immune response elicited to Hepatitis B determines the subsequent clinical outcome. A strong and broad T cell response leads to spontaneous resolution. Conversely, a weak T cell response favours viral persistence and establishment of chronic disease. While treatments using interferon-alpha or nucleos(t)ide analogues can reduce disease progression, they rarely lead to complete recovery. The lack of a suitable small animal model hampered efforts to understand the mechanisms responsible for immune failure in these chronic patients.rnIn current study we used Trimera mice to study the efficacy of potential vaccine candidates using HBV loaded dendritic cells in HBV chronic infection in vivo. The Trimera mouse model is based on Balb/c mice implanted with SCID mouse bone marrow and human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HBV patients, and thus contains the immune system of the donor including their HBV associated T cell defect.rnIn our present study, strong HBV specific CD4+ and CD8+ T cell responses were enhanced by therapeutic vaccination in chronic HBV patients. These T cell responses occurred independently of either the course of the disease or the strength of their underlying HBV specific T cell failure. These findings indicate that the Trimera mouse model represents a novel experimental tool for evaluating potential anti-HBV immunotherapeutic agents. This in vivo data indicated that both the HBV specific CD4+ cell and CD8+ responses were elicited in the periphery. These HBV specific T cells proliferated and secreted cytokines upon restimulation in Trimera mice. The observation that these HBV specific T cells are not detectable directly ex vivo indicates that they must be immune tolerant or present at a very low frequency in situ. HBV specific T cell responses were suppressed in Trimera mice under viremic conditions, suggesting that viral factors might be directly involved in tolerizing or silencing antiviral T cell responses. Thus, combination of an effective vaccine with antiviral treatment to reduce viremia might be a more effective therapeutic strategy for the future. Such approaches should be tested in Trimera mice generated in HBV or HBs expressing transgenic mice before conducting clinical trials.rn