Die molekulare Evolution der Hämoglobin-Genfamilie in Chironomus tentans

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden 74736 bp genomischer DNA-Sequenzder Hämoglobingen-Gruppe D aus der Chironomiden Art Chironomus tentansentschlüsselt und analysiert. Durch Datenbankrecherchen undSequenz-Vergleiche wurden 29 vollständige Hämoglobin-Geneidentifiziert und klassifiziert. Es zeigt sich, daß alle derzeitbekannten Hämoglobin-Gene der Chironomiden auch in Chironomus tentansvorhanden sind. Zusätzlich konnten in Chironomus tentans sechs neueHämoglobin-Varianten identifiziert werden, die bislang weder aufProtein- noch auf Gen-Ebene in anderen Spezies nachgewiesenwurden. Die Hämoglobin-Gene liegen in dichter Abfolge innerhalbdes Clusters, wobei durchschnittlich etwa alle 2 kb ein Gen zufinden ist. Die Abfolge der Hämoglobin-Gene innerhalb derGengruppe wird nur an einer Stelle durch ein interspergiertes Genaus der Familie der Glukosetransporter unterbrochen. Desweiterenkonnten zwei retrotransponierbare Elemente der SINE-Klasse (CP1)innerhalb des Hämoglobingen-Clusters identifiziert werden. AlleGene besitzen die für ihre Expression erforderlichenSignalsequenzen, so daß es sich höchstwahrscheinlich um aktiveGene handelt. Die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen weisen alleCharakteristika sauerstofftransportierender Moleküle auf. Da es sich bei den Hämoglobinen um eine sehr alte Genfamiliehandelt, kann die vergleichende Analyse derHämoglobin-Genstruktur bei Vertebraten, Invertebraten, Pflanzenund Protozoen zur Rekonstruktion der Intron-Evolution genutztwerden. Die Konservierung von Intronpositionen in homologen Genenverschiedener Taxa gilt dabei als Maß für das relativestammesgeschichtliche Alter der Introns. Eine Vielzahl derHämoglobin-Gene von Invertebraten weisen ein Intron im zentralenGenbereich auf. Auch bei einigen Chironomiden-Arten konntendiese 'zentralen Introns' nachgewiesen werden. DieHämoglobin-Gene von Chironomus tentans galten hingegen bislang als intronlos.Die vorliegende Untersuchung zeigt, daß auch zweiHämoglobin-Gene dieser Spezies je ein kurzes Intron aufweisen.Der Vergleich der Intronverteilung in den Hämoglobin-Genen derChironomiden führt zu dem Ergebnis, daß alle vorhandenen Intronsam sparsamsten (im Sinne des 'maximum parsimony'-Prinzips) durchunabhängige Insertionen in ein intronlosesVorläufer-Hämoglobin-Gen erklärt werden können. Alle bislangin Chironomiden beschriebenen Introns sind mit großerWahrscheinlichkeit nicht ortholog (Hankeln et al., 1997; dieseArbeit). Das Vorläufer-Hämoglobin-Gen in Chironomiden besaßdaher vermutlich kein 'zentrales Intron'. Die in Chironomidengefundenen Verhältnisse stellen somit die von Go (1981)formulierte Hypothese der Ursprünglichkeit des 'zentralenIntrons' in Hämoglobin-Genen in Frage. Die in Invertebraten undPflanzen beschriebenen 'zentralen Introns' sind vermutlich nichthomolog und dementsprechend auch nicht auf ein Intron imanzestralen Globin zurückzuführen. Vielmehr implizieren die inhohem Maße variablen Positionen der 'zentralen Introns' beiPflanzen und Invertebraten ihre unabhängige Insertion in diejeweiligen Globin-Gene nach der Aufspaltung der Taxa. Grundsätzlich können zwei Klassen von Hämoglobin-Genen inChironomiden unterschieden werden. Die überwiegende Mehrzahl derHämoglobine wird von Genen kodiert, die nur in einer Kopie imGenom vorliegen. Sie werden dementsprechend als 'single copy'Varianten bezeichnet. Für andere Hämoglobin-Varianten konntehingegen eine Vielzahl leicht unterschiedlicher Gene beschriebenwerden. Diese bilden sogenannte Gen-Subfamilien. In Chironomus tentans konntegezeigt werden, daß neben den 7B-Genen auch die 7A-Gene eineeigene Subfamilie bilden. Die 'single copy' Varianten zeichnensich im Interspezies-Vergleich durch ihre konservierteNukleotid-Sequenz aus: Sie unterliegen während ihrer Evolutionoffenbar einer stabilisierenden Selektion, d.h. Veränderungenihrer Protein-Sequenzen werden nur in geringem Maße toleriert.Auch ihre räumliche Anordnung innerhalb der Gengruppe istzwischenartlich konserviert. Der Vergleich der 'single copy'Varianten innerhalb einer Art zeigt, daß diese sehr deutlicheSequenz-Unterschiede zueinander aufweisen. Sie bilden somit einkonserviertes Sortiment an Hämoglobin-Genen, das weitgehend vorder Radiation der Arten entstanden ist und eine über dieArtgrenzen hinweg unveränderte 'Hämoglobin-Grundausstattung'gewährleistet. Im Gegensatz hierzu zeichnen sich die Mitglieder vonHämoglobin-Gen-Sub-familien durch eine hohe Variabilität aus:Nukleotid-Sequenz, Anzahl und Organisation der Gene innerhalb derGenfamilie weisen im zwischenartlichen Vergleich zahlreicheUnterschiede auf. Es ist daher nur selten möglich allein aufGrundlage der Nukleotid-Sequenzen orthologe Genpaare zuidentifizieren. Die orthologen Gene der 7B-Subfamilie aus Chironomus tentansund chth konnten ausschließlich anhand korrespondierenderIntergen-Sequenzen einander zugeordnet werden. Somit sind dieGen-Subfamilien präferenziell an der Entstehung einesspeziesspezifischen Gen-Repertoires beteiligt. Variationen derNukleotid-Sequenz, Gen-Anzahl und Gen-Organisation innerhalb derSubfamilie werden im Gegensatz zu den 'single copy' Varianten ineinem hohen Maße toleriert. Aufgrund der hohen Sequenz-Übereinstimmungen zwischen denMitgliedern der Gen-Subfamilien unterliegen diese einer Vielzahlvon Rearrangements, die in Gen-Duplikationen, Deletionen undSequenz-Homogenisierungen resultieren. So führten beispielsweiseGenduplikationen durch ungleiches, homologes Crossing-over mitgroßer Wahrscheinlichkeit zur Entstehung und Expansion der7A-Subfamilie. Auch die Gene Cte12-1 und Cte 12-2 sind vermutlichdas Ergebnis eines rezenten Duplika-tions-Ereignisses. DerMechanismus der Retrotransposition, der zu einer Duplika-tioneines 3`-untranslatierten Bereichs innerhalb der 7A-Subfamilieführte, scheint für die Entstehung derHämoglobin-Multiplizität in Chironomiden hingegen wenigerbedeutsam zu sein. Innerhalb der 7A-Subfamilie ist eineAngleichung der Gene durch konzertierte Sequenz-Evolution zubeobachten. Der nukleotidweise Vergleich von Gen-Sequenzen zeigtam Beispiel der Gene 7A7 und 7A8, daß die konzertierte Evolutiondieser Gen-Varianten auf dem Mechanismus der Genkonversionberuht. Auch die Gen-Subfamilie 7B unterliegt offenbar in hohemMaße einer solchen Sequenz-Homogenisierung. Im Sinne einer molekularen Uhr sollten synonyme Basenaustauscheweitgehend neutral sein und sich proportional zur Zeit in denGenen anhäufen. Der Vergleich der Hämoglobin-Gen-Sequenzenzeigt, daß große Unterschiede in der Anzahl der synonymenBasenaustausche zwischen orthologen Genen nicht zwangsläufig dasErgebnis einer frühen Trennung dieser Gene sind. Die Übertragungvon Sequenzen zwischen paralogen Genen kann die Anzahl dersynonymen Basenaustausche orthologer Gene in kürzester Zeitverändern und den tatsächlichen Zeitpunkt der Trennung zweierorthologen Gene überdecken. Werden Genkonversionen nichterkannt, weil beispielsweise nicht alle Gene der Gruppevollständig erfaßt werden konnten, führt der Vergleichorthologer Gen-Sequenzen zwangsläufig zu falschen evolutionärenGendistanzen. Da die Mitglieder der Hämoglobin-Genfamiliebesonders häufig Rekombinations-Prozessen unterliegen, sind siedaher möglicherweise weniger nützliche Kanditaten für dieErmittlung evolutionärer Distanzen zwischen den verschiedenenChironomiden-Arten. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß anhanddetaillierter phylogenetischer Analysen sich die Evolution derHämoglobin-Multigenfamilie von Chironomiden umfassendbeschreiben läßt. Ob einzelne, besonders gut konservierteGen-Varianten (wie z. B. die Gene Cte 8 und Cte W) einespezifische physiologische Funktion erfüllen oder ob dieGen-Subfamilien, die ein speziesspezifisches Genrepertoirebilden, an der Einnischung der verschiedenen Arten beteiligtsind, sollte durch weiterführende Untersuchungen (z. B. derGenexpression sowie der physiologischen Eigenschaften einzelnerVarianten) ermittelt werden können.

Untersuchungen zur Expression und Funktion intrazellulärer Globine

Im Rahmen meiner Dissertation untersuchte ich die intrazelluläre Lokalisation des Hämoglobin von Drosophila melanogaster, sowie von Neuroglobin und Cytoglobin der Vertebraten. Obwohl alle drei Globine erst kürzlich entdeckt wurden, liegen bereits Daten über ihre Struktur, ihre biochemischen Eigenschaften und die Lokalisation der mRNA vor. Ihre Funktionen konnten bisher jedoch nicht eindeutig geklärt werden. Das Globin von Drosophila melanogaster konnte mittels Westernblot sowohl in Larven als auch adulten Fliegen nachgewiesen werden. Ebenso war es mir möglich, mittels Immunperoxidaseuntersuchungen die Tracheen, die Terminalzellen der Tracheolen sowie die Fettkörperzellen als Ort der Globinexpression in Drosophila zu identifizieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass dieses Globin eine Funktion als Sauerstoffpuffer, der sowohl Sauerstoff speichert als auch transportiert, hin. Damit würde das Drosophila Globin eine zu anderen Insektenglobinen vergleichbare Funktion übernehmen. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass Neuroglobin auch in der neuronalen Netzhaut von Säugern und Fischen vorkommt. Des Weiteren konnte Neuroglobin in der Retina zellulär sowie subzellulär lokalisiert werden. In der avaskulären Mäuseretina wurde Neuroglobin neben den Innensegmenten der Photorezeptorzellen, auch noch in den beiden plexiformen Schichten sowie in der Ganglienzellschicht gefunden. Die gezeigte Kolokalisation dieses intrazellulären Globins mit Mitochondrien und somit auch mit den Orten des höchsten Sauerstoffbedarfs in der Retina deutet auf eine Funktion im Sauerstofftransport zu den Mitochondrien hin. Des Weiteren könnte Neuroglobin auch als Sauerstoffspeicher dienen, der es Neuronen ermöglicht, kurzfristige hypoxische Bedingungen unbeschadet zu überstehen. Andere mögliche Funktionen wie z.B. die als Detoxifizierer von reaktiven Sauerstoff- bzw. Sickstoffverbindungen, als Sauerstoffsensor, sowie als terminale Oxidase erscheinen durch die gezeigten Daten eher unwahrscheinlich. Die bisherige Annahme, dass Cytoglobin ein ubiquitär exprimiertes Protein ist, konnte von mir nicht bestätigt werden. Für nichtneuronale Gewebe konnte gezeigt werden, dass Cytoglobin lediglich auf das Cytoplasma von Fibroblasten und ontogenetisch verwandte Zelltypen wie Osteoblasten, Chondroblasten und Sternzellen beschränkt ist. Möglicherweise hat Cytoglobin dort eine Funktion in der Kollagensynthese. Ferner wird Cygb cytoplasmatisch und nukleär in einigen Neuronen der Retina und des Gehirns exprimiert. Dort könnte Cygb z.B. nukleäre Enzyme wie die NO-Synthase mit Sauerstoff versorgen. Andere Funktionen scheinen aufgrund meiner Daten im Moment unwahrscheinlich.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Untersuchungen zur Globinexpression in Karpfenfischen

In der vorliegenden Arbeit untersuchte ich die Diversität und die sauerstoffabhängige Expression der Globine von Karpfenfischen. Mit Globin X konnte ein fünfter Globintyp identifiziert werden, dessen Vorkommen auf Fische und Amphibien beschränkt ist. Globin X wird sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in zahlreichen Geweben exprimiert. Zur Aufklärung der genauen Funktion müssen noch weitere Analysen durchgeführt werden. Phylogenetische Untersuchungen ergaben eine ursprüngliche Verwandtschaft zwischen Neuroglobin und Globin X und deuten darauf hin, dass der letzte gemeinsame Vorfahre der Protostomia und Deuterostomia bereits zwei verschiedene Globintypen besessen hat. Im Zebrabärbling und im Goldfisch konnte ich eine Myoglobin-Expression neben dem Herzen auch in Hirn, Kieme, Leber und Niere nachweisen und somit zeigen, dass Myoglobin nicht nur im Muskelgewebe lokalisiert ist. Des Weiteren konnte eine hirnspezifische Myoglobin-Isoform im Goldfisch identifiziert werden, deren Funktion noch unklar ist und weiterer Untersuchungen bedarf. Das Vorhandensein der zweiten Isoform ist innerhalb der Cyprinidae (Karpfenfische) aufgrund einer Genomduplikation bei den Cyprininae (Kärpflinge) auf diese Unterfamilie beschränkt. Durch Hypoxieexperimente konnte gezeigt werden, dass die Expression der Globine von der Intensität des Sauerstoffmangels abhängig ist und gewebe- und artspezifisch erfolgt. Im Zebrabärbling wurde eine Abnahme der Hämoglobin- und Globin X-Konzentration beobachtet, während das Cytoglobin-Expressionsniveau nahezu unverändert blieb. Im Fall von Myoglobin und Neuroglobin konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die hypoxieinduzierte Zunahme der mRNA-Menge auch mit einer verstärkten Expression des jeweiligen Proteins korreliert ist. Im Vergleich dazu war die Veränderung der Expression der meisten Globine im Goldfisch gering, lediglich Myoglobin wurde im Fischkörper auf mRNA-Ebene nach Hypoxie deutlich verstärkt exprimiert. Durch einen Vergleich der konstitutiven Neuroglobin-Expression beider Karpfenfische konnte in Auge und Hirn des hypoxietoleranten Goldfisches eine 3- bzw. 5-fach höhere Neuroglobin-Konzentration als im hypoxiesensitiven Zebrabärbling nachgewiesen werden. Meine Ergebnisse stützen somit die Hypothese, dass Neuroglobin eine myoglobinähnliche Funktion einnimmt und den aeroben Stoffwechsel im neuronalen Gewebe auch unter Sauerstoffmangel aufrechterhält.

Neuroglobin, Cytoglobin und Myoglobin in der Blindmaus Spalax ehrenbergi: Adaptation an „unterirdische Verhältnisse“

Hypoxie ist ein Zustand des Sauerstoffmangels, hervorgerufen durch fehlende Verfügbarkeit von Sauerstoff in der Umgebung eines Organismus oder durch pathologisch bedingte unzureichende Nutzbarkeit des Sauerstoffs von Geweben. Die Sensitivität gegenüber Hypoxie variiert enorm im Tierreich zwischen verschiedenen Phyla und Spezies. Die meisten Säugetiere sind nur unzureichend an niedrige Sauerstoffkonzentrationen angepasst, wohingegen einige unterirdisch lebende Säuger sehr resistent gegen Hypoxiestress sind. Um die molekulare Basis der Hypoxietoleranz zu bestimmen, wurden in der vorliegenden Arbeit Globine untersucht, die potenziell in der Lage sind, als respiratorische Proteine zur Hypoxietoleranz von Tieren beizutragen. Dazu wurde die Expression der Globine in der hypoxieresistenten, in Israel lebenden Blindmaus Spalax ehrenbergi mit der Genexpression in der hypoxiesensitiven Ratte (Rattus norvegicus) verglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die erst vor wenigen Jahren entdeckten Globine Neuroglobin und Cytoglobin untersucht, deren exakte physiologische Rolle noch unklar ist, und mit Daten des viel detaillierter untersuchten Myoglobins verglichen. Beim Vergleich der Expression von Cytoglobin und Neuroglobin in Spalax versus Ratte fällt auf, dass Neuroglobin und Cytoglobin bereits unter normoxischen Bedingungen auf mRNA- und Proteinebene in der Blindmaus um einen Faktor von mindesten 2 bis 3 verstärkt exprimiert werden. Bei Myoglobin (als dem Kontrollgen mit bekannter Funktion) konnte auf mRNA-Ebene eine noch weitaus stärkere Expression in Spalax vs. Ratte gefunden werden. Das übergreifende Phänomen der verstärkten Genexpression von Globinen in Spalax kann im Sinne einer Präadaptation an das unterirdische, häufig hypoxische Leben der Blindmaus interpretiert werden. Einen weiteren Hinweis auf eine besondere, spezialisierte Funktion von Neuroglobin in Spalax geben immunhistochemische Daten, die zeigen, dass Neuroglobin im Gehirn von Spalax im Gegensatz zur Ratte nicht nur in Neuronen, sondern auch in Gliazellen exprimiert wird. Dies impliziert Änderungen des oxidativen Stoffwechsels im Nervensystem der hypoxietoleranten Spezies. Die zellulären Expressionsmuster von Cytoglobin erscheinen hingegen in beiden Säugerspezies weitgehend identisch. Es wurde der Frage nachgegangen, ob und wie experimentell induzierte Hypoxie die Genexpression der Globine verändert. Dabei zeigten sich für Neuroglobin und Cytoglobin unterschiedliche Expressionsmuster. Neuroglobin wird unter diversen Sauerstoffmangelbedingungen sowohl in der Ratte als auch in Spalax auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert. Ein ähnliches Regulationsverhalten wurde auch für Myoglobin beobachtet. Die verminderte Expression von Neuroglobin (und evtl. auch Myoglobin) unter Hypoxie ist mit einer gezielten Verringerung der Sauerstoff-Speicherkapazität in Abwesenheit von O2 zu erklären. Ein weiterer denkbarer Grund könnte auch die allgemeine Tendenz sein, unter Hypoxie aus Energiespargründen den Metabolismus herunter zu regulieren. Cytoglobin, das bei normalen Sauerstoffbedingungen nur im Gehirn von Spalax (nicht jedoch in Herz und Leber) ebenfalls um Faktor 2 bis 3 stärker exprimiert wird als in der Ratte, ist mit einiger Sicherheit ebenfalls von adaptivem Nutzen für die Anpassung von Spalax an niedrige Sauerstoffbedingungen, wenngleich seine Funktion unklar bleibt. Unter Hypoxie wird die Cytoglobin-mRNA sowohl in Spalax als auch in der Ratte hochreguliert. Es konnte in der vorliegenden Arbeit dargelegt werden, dass die Expression von Cygb höchstwahrscheinlich durch den Transkriptionsfaktor Hif-1 gesteuert wird, der die molekulare Hypoxieantwort vieler Tierarten zentral steuert. In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls die Expression von Ngb und Cygb im Gehirn des Hausschweins (Sus scrofa) untersucht. Diese Spezies diente in der Arbeit als weiterer hypoxiesensitiver Organismus sowie als biomedizinisch relevantes Modell für eine Operation an Säuglingen mit angeborenen Herzkrankheiten. Die Versuche haben gezeigt, dass die Gabe bestimmter Medikamente wie dem Immunsuppressivum FK506 zu einer erhöhten Ngb-Konzentration auf mRNA-Ebene führen kann, was potenziell im Zusammenhang mit beobachteten protektiven Effekten der Medikamentengabe während und nach der Herzoperation steht.

Das Globingen-Repertoire von Amphibien und Teleostiern

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die molekulare Evolution von Globinen in Amphibien und Teleostiern untersucht und Analysen zur Genexpression ausgewählter Globine durchgeführt. Die bisher besonders für die neueren Mitglieder der Superfamilie der Globine – Neuroglobin und Cytoglobin – schwerpunktmäßig in Mammaliern erbrachten Daten sollten durch die Analyse in Amphibien und Teleostiern auf ihre generelle Gültigkeit für Vertebraten überprüft werden. Die Analysen zur Genexpression wurden sowohl in silico, basierend auf genomischen wie EST-Daten, als auch experimentell durch qualitative und quantitative RT-PCR-Nachweise durchgeführt. Die mRNA-Lokalisation wurde durch in situ-Hybridisierungen an Gewebeschnitten beziehungsweise durch Whole mount in situ-Hybridisierung an ganzen Embryonen detektiert. In einem ersten Teil der Arbeit wurde das Globin-Repertoire von Xenopus tropicalis umfassend analysiert. Die Expressionsanalyse der gefundenen Globine umfasste nicht nur adulte Tiere, sonder erstmals auch detailliert die Entwicklungsstadien eines Vertebraten. Dabei wurde festgestellt, dass die vorwiegend neuronale Expression des streng konservierten Neuroglobins ein generelles Charakteristikum aller Tetrapoden ist und bereits in der frühembryonalen Entwicklung auftritt. Auch für das als Einzelkopie im Amphibiengenom vertretene Cytoglobin konnte eine strenge Sequenzkonservierung gezeigt werden. Das Expressionsmuster des Amphibien-Cytoglobins stimmte mit dem aus Mammaliern bekannten überein und zeigte konservierte Charakteristika dieses Globins bei Tetrapoden auf. Die Analyse des Xenopus-Genoms ergab zudem, dass Krallenfrösche nicht über Myoglobin verfügen. Genomische Vergleiche syntäner Genregionen ließen auf Rearrangements in diesem Genombereich im Verlauf der Evolution schließen, in deren Folge das Myoglobingen in den Krallenfröschen deletiert wurde. Die Hämoglobine wurden in Xenopus tropicalis erstmals in einem Amphibium umfassend analysiert. Die Gene zeigten demnach eine geclusterte Anordnung: der tropische Krallenfrosch verfügte über je ein funktionelles α- bzw. β-adultes und sieben bzw. vier α- bzw. β-larvale Hämoglobine, die während der Entwicklung bzw. in adulten Tieren charakteristisch exprimiert wurden. Die Analyse der Hämoglobine hinsichtlich ihrer Lage in einem Cluster, ihrer phylogenetischen Relation zueinander und nicht zuletzt ihres Expressionsmusters ließen Rückschlüsse auf ihre Evolution zu. Zusätzlich zu diesen bereits bekannten Globinen konnte im Rahmen dieser Dissertation das Globingen-Repertoirs von Xenopus um zwei weitere, bisher unbekannte Globine erweitert werden. Diese wurden entsprechend ihrer bisher unbekannten Funktion als GlobinX und GlobinY bezeichnet. Während GlobinY bisher ausschließlich in Amphibien nachgewiesen werden konnte, wurde GlobinX zudem in Teleostiern detektiert und repräsentiert damit ein auf Anamnia beschränktes Globin. Die rekombinante Proteinexpression von Neuroglobin, Cytoglobin, GlobinX und GlobinY des tropischen Krallenfrosches zeigte ein hexakoordiniertes Bindungsschema dieser Globine in ihrem Deoxy-Zustand. In einem zweiten Teil dieser Dissertation wurden Neuroglobin und Cytoglobin in Teleostiern untersucht und die Analyse für diese zwei Gene somit über die Tetrapoden hinaus auf den gesamten Stammbaum der Vertebraten ausgedehnt. Dabei wurde deutlich, dass die vorwiegend neuronale Expression des seit 420 Millionen Jahren streng konservierten Neuroglobins ein generelles Merkmal dieses Globins in allen Vertebraten ist. Der in Amphibien und Teleostiern erbrachte und mit Ergebnissen in Mammaliern übereinstimmende Nachweis von Neuroglobin in neuronalen Geweben mit einem hohen Stoffwechsel lässt derzeit eine Funktion dieses Globins im Sauerstoffmetabolimus als wahrscheinlich erscheinen. Ob Neuroglobin dabei als kurzzeitiger Sauerstoffspeicher, O2-Transoprter oder aber in der Detoxifikation reaktiver Sauerstoff- bzw. Stickstoffspezies agiert, bleibt zu untersuchen. Für Cytoglobin konnte eine offenbar alle Teleostier betreffende Genduplikation nachgewiesen werden. Phylogenetische Analysen zeigen die Monophylie der Vertebraten-Cytoglobine. Der Vergleich der paralogen Cytoglobine der Teleostier mit dem syntänen Genombereich des humanen Cytoglobins zeigte die wahrscheinliche Entstehung der Fisch-Cytoglobine durch eine Genomduplikation in einem Vorfahren aller Teleostier vor etwa 300-450 Millionen Jahren. Die paralogen Cytoglobine zeigten in Danio rerio und Tetraodon nigroviridis differierende, charakteristische Expressionsmuster, die mit der Theorie der Subfunktionalisierung von Genen in Folge eines Duplikationsereignisses kompatibel sind. Die Analyse zeigte, dass Cygb-1 prädominant in Gehirn und Herz exprimiert wurde, Cygb-2 hingegen bevorzugt in Gehirn und Auge. Dies bestätigte indirekt die Hypothese, nach der das Cytoglobin der Mammalier zwei unterschiedliche Funktionen in differenten Geweben wahrnimmt. Die rekombinante Expression von Cygb-1 des Zebrabärblings zeigte zudem, das auch dieses Globin in seiner Deoxy-Form über ein hexakoordiniertes Bindungsschema verfügt.

Untersuchungen zur Expression und Lokalisation der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Säugern

Die vorliegende Dissertation beinhaltet Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Nbg) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten. rnrnUm die Expression der Globine während der Entwicklung des Säugerhirns zu untersuchen, wurden die Hirne von Maus-Embryonen ab dem Fötalstadium MF10 bis zum Tag eins nach der Geburt (T1) mit Adulttieren verglichen. Quantifiziert wurde sowohl die mRNA- als auch die Protein-Expression. Beide Globine zeigten im Verlauf der Entwicklung einen stetigen Anstieg der mRNA-Expression, wobei Ngb zu Beginn in zehnfach höherer Konzentration vorlag und im zeitlichen Verlauf einen 130-fachen Anstieg zeigte. Cygb zeigte lediglich einen 16-fachen Anstieg bis zum Adultstadium. Auf Proteinebene konnte die Expressionszunahme beider Globine im Laufe der Entwicklung bestätigt werden. Weder in den hypoxieresistenten Frühembryonalstadien noch während der mit Sauerstoff-Stress verbundenen Geburt zeigte sich ein Expressionsmaximum. Dies spricht gegen eine Globin-Funktion in der Oxidanz-Abwehr. Eher ist zumindest Ngb mit der Reifung der Neurone und dem damit einhergehenden, gesteigerten oxidativen Stoffwechsel assoziiert.rnrnDes Weiteren sollte die zelluläre und intrazelluläre Lokalisation beider Globine anhand einer primären Zellkultur aus dem Hippocampus pränataler Ratten und in immortalen Zelllinien untersucht werden. Neuroglobin wurde dabei nur in Neuronen, nicht jedoch in Gliazellen nachgewiesen. Das Färbemuster war in allen Ngb-exprimierenden Zellen zytoplasmatisch. Cytoglobin wurde in der Primärkultur in den Neuronen jedoch ebenso in den mit anti-GFAP markierten Gliazellen beobachtet. In beiden Zellpopulationen war auch der Kern durch das CyGB-Antiserum markiert. rnEine genauere Untersuchung der intrazellulären Lokalisation sollte durch die Transfektion von Globin-pEGFP-Fusionsproteinen erfolgen. Nach Transfektion der Fusionskonstrukte wurde die GFP-Färbung bei beiden Globinen sowohl im Zytoplasma als auch im Kern beobachtet. Eine rein nukleäre Lokalisation, die insbesondere für Cygb von anderen Autoren postuliert wurde, konnte somit ausgeschlossen werden. rnrnIn primären Zellkulturen aus Cerebellum und Kortex, die mit Hilfe von Paraquat oxidativem Stress ausgesetzt wurden, wurde der Verlauf der Globin-mRNA-Expression mit dem unregulierten 18s rRNA-Referenzgen und mit den Antioxidanz-Enzymen Cu-Zn-SOD und Gpx verglichen. Neuroglobin zeigte einen Expressionsverlauf ähnlich dem der beiden Antioxidanz-Enzyme, jedoch liegt seine mRNA im Hirngewebe in hundertfach niedrigerer Menge als Cu-Zn-SOD und Gpx vor. Cytoglobin zeigte keine Veränderung der Expression. Eine Funktion der Globine im Sinne einer ROS-Abwehr kann aus den Befunden nicht abgeleitet werden. rnrnUntersuchungen von Tumor und Normalgewebe mittels eines cDNA-Cancer-Arrays zeigten, dass NGB in Tumoren verschiedenen Ursprungs nicht exprimiert wird, CyGB dagegen keine Änderung seiner Expression in Tumor versus Normalgewebe erfährt. Eine Induktion der beiden Globine z.B. durch Hypoxie in soliden Tumoren kann daher ausgeschlossen werden.rn

Funktionsaufklärung von Atmungsproteinen in Insekten

Globine sind kleine globuläre Proteine mit nahezu ubiquitärem Vorkommen in allen Tiergruppen. Sie weisen eine typische Sandwichstruktur auf, die in der Regel aus acht α-Helices mit einer zentralen prosthetischen Häm-Gruppe besteht und die Proteine zur Bindung gasförmiger Liganden befähigt. Die Funktionen der Globine reichen von O2-Transport und – Speicherung, über eine Beteiligung bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies bis hin zu sensorischen physiologischen Aufgaben. Innerhalb der Klasse der Insekten schien das Vorhandensein von Globinen zunächst auf Insekten mit offensichtlich hypoxischen Habitaten beschränkt zu sein. Die Entdeckung des Globins glob1 in Drosophila melanogaster deutete jedoch eine sehr viel weitere Verbreitung der Globine in Insekten an, die sich durch die Identifizierung von Globingenen in einer Vielzahl von normoxisch lebenden Insekten, wie z.B. Apis mellifera oder Aedes aegypti bestätigte. D. melanogaster besitzt drei Globine, glob1, glob2 und glob3. Glob1 ist eng mit anderen intrazellulären Insektenglobinen verwandt, was zu der Annahme führte, dass es sich bei glob1 um das ursprüngliche und bei glob2 und glob3 um abgeleitete D. melanogaster Globine handelt. Glob1 wird in allen Entwicklungsstadien exprimiert, wobei die Hauptexpressionsorte der Fettkörper und das Tracheensystem sind. Die Transkription des glob1 startet von zwei alternativen Promotoren (Promotor I und II), wodurch in Kombination mit alternativem Splicing vier Transkriptvarianten (Isoform A-D) entstehen, deren Translation jedoch in einer Proteinvariante (glob1) resultiert. Hypoxische Bedingungen führen zu einer vermutlich HIF (=‚hypoxia-inducible factor‘) -vermittelten Abnahme der glob1 Genexpression, wohingegen Hyperoxie eine leichte Zunahme der glob1 mRNA Menge bewirkt. Der mithilfe des UAS/Gal4- Systems erzeugte, RNAi-vermittelte glob1 Knockdown führt zu einer schlechteren Überlebensrate adulter Fliegen unter hypoxischen Bedingungen, einer verkürzten Erholungszeit nach hypoxischem Stupor in Weibchen sowie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem ROS (=‘reactive oxygen species‘) -generierenden Herbizid Paraquat in Larven und adulten Weibchen. Diese Beobachtungen sprechen für eine Funktion des Drosophila glob1 innerhalb der O2-Versorgung. Unter hyperoxischen Bedingungen hingegen wurde kein Unterschied zwischen Fliegen mit wildtypischer und manipulierter glob1-Expression festgestellt, wodurch eine Beteiligung des glob1 bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies als mögliche Funktion vorerst ausscheidet. Bei glob2 und glob3 handelt es sich um duplizierte Gene. Auf phylogenetischen Rekonstruktionen basierend konnte die Entstehung der Globin-Duplikate auf ein Duplikationsereignis vor der Radiation des Subgenus Sophophora vor mindestens 40 Millionen Jahren zurückgeführt werden. Die durchgeführten Analysen zur molekularen Sequenzevolution der Globin-Duplikate deuten darauf hin, dass glob2 und glob3 nach der Duplikation eine Kombination aus Sub- und Neo-Funktionalisierungsprozessen durchlaufen haben. Glob2 und glob3 zeigen eine deckungsgleiche mRNA Expression, die auf die männliche Keimbahn beschränkt ist. Aufgrund des hohen Konservierungsgrads der für die Häm- und O2-Bindung essentiellen Aminosäuren kann von der Funktionalität beider Proteine ausgegangen werden. Die streng auf die männliche Keimbahn begrenzte Expression von glob2 und glob3 deutet auf eine Rolle der Globin-Duplikate innerhalb der Spermatogenese hin, die möglicherweise in einem Schutz der Spermatogenese vor oxidativem Stress besteht. Auch eine Beteiligung beim korrekten Ablauf der Spermien-Individualisierung, beispielsweise durch Regulation von Apoptoseprozessen wäre denkbar.