Untersuchungen zur Bedeutung von Histidinkinasen in Magnaporthe oryzae und zum Wirkmechanismus des Fungizids Fludioxonil

Das aus wissenschaftlicher und ökonomischer Sicht wichtigste Pflanzenpathogen M. oryzae entwickelte im Laufe der Evolution konservierte aber auch einzigartige Mechanismen zur Signaltransduktion. Das Erforschen dieser Mechanismen und Prozesse ist essenziell für das Verständnis von Differenzierungsprozessen bei der Pathogen-Wirt-Interaktion.rnIm ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Signalweg zur Osmoregulation, der „High Osmolarity Glycerol“ (HOG)-Signalweg, erstmals anhand physiologischer Experimente in entsprechenden Mutantenstämmen in M. oryzae untersucht. Dabei konnten klare Unter-schiede zum HOG-Signalweg von S. cerevisiae aufgezeigt werden. rnDas in M. oryzae bisher noch nicht beschriebene Gen MoYPD1, welches das Phosphotransferprotein MoYpd1p kodiert, wurde erfolgreich inaktiviert. Diese Inaktivierung ist in S. cerevisiae und vielen anderen Pilzen letal und resultierte bei M. oryzae in einer apathoge¬nen Albinomutante, deren Konidiogenese gestört ist. Insbesondere die Funktion des Phosphotransferproteins MoYpd1p, sowohl im Phosphorelaysystem des HOG-Signal¬wegs als auch im Wirkmechanismus des Fungizids Fludioxonil, konnte eindeutig mittels Y2H- und Western Blot-Analysen nachgewiesen werden.rnEs wurden entscheidende Fortschritte für das Verständnis des Aufbaus und der Funktion des HOG-Signalwegs sowohl als physiologisches Regulationssystem für Umweltreize als auch als Fungizidtarget im Pflanzenschutz erzielt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zweikompo-nenten-Hybrid-Histidinkinase (HIK) MoSln1p als Signalsensor für Salzstress und MoHik1p als Signalsensor für Zuckerstress fungiert. Die Beteiligung der Histidinkinasen MoHik5p und MoHik9p als Sensorproteine für Hypoxie im HOG-Signalweg ist durchaus denk¬bar und wurde durch erste Ergebnisse bekräftigt. rnSo konnte der HOG-Signalweg in mehreren Modellen dargestellt werden. Die Modelle der Signalerkennung und –transduktion von osmotischem Stress, von Hypoxie und der Wirkmecha¬nismus von Fludioxonil wurden erstmals in diesem Umfang für M. oryzae ausgearbei¬tet.rnDer zweite Teil dieser Arbeit repräsentiert die erste umfassende Untersuchung aller zehn HIK-codierender Gensequenzen, die im Genom von M. oryzae identifiziert werden konnten. Diese Signalproteine waren bisher noch nicht Gegenstand wissenschaftlicher Studien. Die Untersuchung beginnt mit einer phylogenetischen Einordnung aller untersuchten Proteinsequen¬zen in die verschiedenen Gruppen von Histidinkinasen in Pilzen. Eine ausführli-che phänotypische Charakterisierung aller HIK-codierender Gene folgt und wurde anhand von Mutanten durchgeführt, in denen diese Gene einzeln inaktiviert wurden.rnDie Beteiligung von MoHik5p und MoHik9p als mögliche Sauerstoffsensoren im HOG-Signal-weg konnte dokumentiert werden und die anschließenden Western Blot-Analysen bestätig¬ten erstmals die Aktivierung des HOG-Signalwegs bei hypoxieähnlichen Zuständen.rnDes Weiteren wurden mit MoHik5p und MoHik8p zwei neue Pathogenitätsfaktoren in M. oryzae identifiziert. Die apathogenen Mutantenstämme ΔMohik5 und ΔMohik8 sind in der Konidiogenese gestört und nicht in der Lage Appressorien zu differenzieren. Der Einsatz dieser Proteine als Fungizidtarget im protektiven Pflanzenschutz in der Zukunft ist somit denk-bar.rn

Studien zur Totalsynthese von Monilicin und strukturverwandten Naturstoffen

Ziel dieser Arbeit war die Totalsynthese von Monilicin. Seine Chlor- und Brom-Derivate wurden aus Monilinia fructicola isoliert und zeigten fungizide Wirkung. Die Schlüsselschritte der Synthese sind der Aufbau des ε-Lakton, die Einführung der exozyklischen Carboxymethyl-Gruppe und der Einbau der Doppelbindung in das Lakton. Es wurden drei Synthesestrategien verfolgt, wobei die Bildung des Laktons über eine Veresterung erfolgen sollte.rnÜber enantioselektive Syntheseschritte sollten die reinen Enantiomere erhalten werden. Ausgehend vom Orcinol erfolgte auf allen Syntheserouten zuerst der Aufbau des 5-Hydroxy-7-methylchromon-Grundgerüstes, und anschließend dessen Funktionalisierung in den Positionen 2 und 3. Der Ringschluss zum ε-Lakton gelang über eine Steglich-Veresterung. Syntheseweg A lieferte nach der Oxidation der primären exozyklischen Alkoholgruppe und anschließender Methylierung das Dihydromonilicin. Auf dem Syntheseweg B gelang die Einführung der späteren exozyklischen Carboxymethyl-Gruppe vor der Laktonisierung. Aus der Dicarbonsäure konnte zum ersten Mal auch der Naturstoff Oxalicumon C totalsynthetisch dargestellt und seine absolute Konfiguration aufgeklärt werden. Nach selektiver Hydrolyse konnte aus Oxalicumon C ebenfalls das Dihydromonilicin synthetisiert werden. Die Darstellung von Monilicin durch Einführung der Doppelbindung in das Dihydromonilicin oder bereits vor der Laktonisierung (Syntheseweg C) konnte nicht erreicht werden. Einige der Chromon-Derivate zeigten fungizide und zytotoxische Aktivitäten. rn