Substratversorgung von NO-Synthasen

Resultate dieser Arbeit zeigen, dass endotheliale und neuronale NO-Synthasen (eNOS und nNOS) ihr Substrat Arginin nicht ausschließlich aus extrazellulären, sondern auch aus intrazellulären Quellen beziehen. Das Substrat aus den intrazellulären Quellen scheint nicht über Membrantransporter in den Extrazellulärraum gelangen zu können. Dies deutet darauf hin, dass eine enge Assoziation der Arginin-bereitstellenden Enzyme mit eNOS bzw. nNOS vorliegen könnte. Dadurch würde das durch diese Enzyme generierte Arginin direkt an die NOS weitergereicht und nicht über Transporter gegen andere basische Aminosäuren (AS) im Extrazellulärraum ausgetauscht werden. Eine intrazelluläre Substrat-Quelle besteht aus dem so genannten „Recycling“, der Umwandlung des bei der NO-Synthese entstehenden Citrullins in Arginin. Eine Kopplung von Arginin-bereitstellenden „Recycling“-Enzymen mit NOS wird in Endothelzellen und teilweise auch in TGW-nu-I Neuroblastomzellen beobachtet, nicht jedoch in A673 Neuroepitheliomzellen. Die Kopplung scheint daher vom Zelltyp abhängig zu sein. Das zur Arginin-Regeneration benötigte Citrullin kann allen untersuchten Zellen durch den Austausch mit spezifischen neutralen AS, die ausschließlich zum Substratprofil des System N Transporters SN1 passen, entzogen werden. Die Anwesenheit von SN1-Substraten im Extrazellulärraum führt daher indirekt zu einer Depletion der Recycling-Quelle. SN1 mRNA ist in allen untersuchten Zellen nachweisbar. Aus Protein-Abbau stammendes Arginin stellt den zweiten Teil der intrazellulären Arginin-Quelle dar. Dieser ist in allen untersuchten eNOS- oder nNOS exprimierenden Zellen vorhanden. Das Arginin stammt dabei sowohl aus lysosomalem als auch proteasomalen Proteinabbau, wie der Einsatz spezifischer Inhibitoren zeigt. Extrazelluläres Histidin (aber keine andere Aminosäure) kann diese Arginin-Quelle depletieren. Wir vermuten deshalb, dass Histidin über den Peptid-Histidin-Transporter PHT1, der in allen untersuchten Zellen stark exprimiert ist, gegen die durch lysosomalen und proteasomalen Proteinabbau entstehenden Arginin-haltigen Di- und Tripeptide ausgetauscht wird. Der wichtigste endogene NOS-Inhibitor, asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), ein Marker für endotheliale Dysfunktion und Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, stammt ebenfalls aus Proteinabbau. Die Verfügbarkeit dieser intrazellulären Arginin-Quelle wird deshalb stark vom Methylierungsgrad des Arginins in den abgebauten Proteinen abhängen. Eine lokale ADMA-Anreicherung könnte eine Erklärung für das Arginin-Paradox sein, der unter pathophysiologischen Bedingungen beobachteten Verminderung der endothelialen NO-Synthese bei anscheinend ausreichenden intrazellulären Argininkonzentrationen. Da auch in neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, ADMA eine Rolle zu spielen scheint, könnte das Arginin-Paradox auch für die nNOS-vermittelte NO-Synthese von Bedeutung sein. Die Resultate demonstrieren, dass die Substratversorgung der beiden NOS-Isoformen nicht ausschließlich von kationischen Aminosäuretransportern abhängig ist, sondern auch von Transportern für neutrale Aminosäuren und Peptide, und außerdem von Arginin-bereitstellenden Enzymen. Der jeweilige Beitrag der verschiedenen Arginin-Quellen zur Substratversorgung der NOS ist daher abhängig vom Anteil der jeweiligen Aminosäuren und Peptide in der extrazellulären Flüssigkeit.

Regulation der Sphingosinkinase 1 und 2 und der neutralen Ceramidase in renalen Mesangiumzellen der Ratte

In den letzten Jahren gewann die Erforschung des Sphingolipidstoffwechsels in den verschiedensten Zellsystemen immer mehr an Bedeutung, da es sich zeigte, dass einige Sphingolipidspezies, vor allem Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat, als wichtige intra- und extrazelluläre Botenstoffe wirken und bei einer Vielzahl unterschiedlicher zellulärer Antworten, wie Apoptose, Proliferation und Migration, eine wichtige Rolle spielen. Während Ceramid eher pro-apoptotisch und wachstumshemmend wirkt, begünstigt Sphingosin-1-Phosphat als „Gegenspieler“ eher die Proliferation und das Zellwachstum. Ceramid kann relativ schnell in Sphingosin-1-Phosphat umgewandelt werden durch die Wirkung zweier Enzymklassen, den Ceramidasen und den Sphingosinkinasen. Konsequenterweise ist die Regulation dieser Enzyme von entscheidender Bedeutung für das zelluläre Gleichgewicht zwischen Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Wirkung von extrazellulären Nukleotiden, die ebenfalls als Regulatoren zahlreicher zellulärer Antworten, wie z.B. Proliferation und Migration, bekannt sind und über entsprechende Oberflächenrezeptoren, die Purinrezeptoren, wirken, auf die Aktivität besonders der Sphingosinkinasen 1 und 2 näher untersucht. Es sollte geklärt werden, ob die Sphingosinkinasen an einigen durch extrazelluläre Nukleotide induzierbaren zellulären Antworten, in diesem Falle der Migration und der Proliferation von Zellen, beteiligt sind. Als Zellsystem wurden Nierenmesangiumzellen verwendet, da diese Zellen bei verschiedenen entzündlichen Nierenerkrankungen (Glomerulonephritiden) eine wichtige Rolle spielen. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass extrazelluläre Nukleotide die Aktivität der Sphingosinkinase 1 in den Mesangiumzellen stimulieren können. Zu beobachten ist dabei eine biphasische Aktivitätssteigerung der Sphingosinkinase 1. Die erste Aktivitätssteigerung nach einer Kurzzeitstimulation ist dabei auf eine Phosphorylierung des Enzyms zurückzuführen, während die zweite Aktivitätssteigerung mit einer Aktivierung des Sphingosinkinase 1-Promotors, einer verstärkten mRNA-Expression und einer de novo Proteinsynthese zu erklären ist. Diese Induktion kann durch die Verwendung von Hemmstoffen des PKC- und MAPK-Signalweges, sowie durch Verwendung eines Transkriptions- (Actinomycin D) oder eines Translationsinhibitors (Cycloheximid) blockiert werden. Die Halbwertszeit der mRNA der Sphingosinkinase 1 in den Mesangiumzellen konnte auf ca. 20 Minuten bestimmt werden. Im Gegensatz dazu ist die Sphingosinkinase 2 nicht durch ATP aktivierbar, wohl aber durch diverse Abbauprodukte von ATP, wie AMP und Adenosin, sowie durch UTP und seine Abbauprodukten UDP und UMP. Die neutrale Ceramidase kann nicht durch ATP und UTP aktiviert werden, wohl aber durch P2X7-Rezeptoragonisten (Bz-ATP, αβ-Me-ATP, γS-ATP) und TPA. In einem zweiten Schritt wurde die Rolle der Sphingosinkinasen und der neutralen Ceramidase bei der durch extrazelluläre Nukleotide induzierten Migration und Proliferation untersucht. Es zeigte sich mit Hilfe von genspezifischer siRNA zur Depletion der Sphingosinkinasen und der neutralen Ceramidase, sowie durch Verwendung von Kinase-Hemmstoffen und damit einhergehend der Inhibierung der Signalwege und mit Hilfe von verschiedenen Zelllinien isoliert aus Wildtyp-, SPHK 1-überexprimierenden und mSPHK1-defizienten Mäusen, dass die Aktivierung der Sphingosinkinase 1 durch extrazelluläre Nukleotide von entscheidender Bedeutung für die Migrationsfähigkeit der Zellen ist, jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Proliferationsrate der Mesangiumzellen hat. Auch die Aktivität der neutralen Ceramidase ist von entscheidender Bedeutung für die Migrationsfähigkeit der Zellen. Durch Depletion der neutralen Ceramidase scheint Ceramid in den Zellen zu akkumulieren, was die Proliferationsrate reduziert. Für die Proliferation der Mesangiumzellen könnte die Sphingosinkinase 2 als negativer Regulator fungieren, wie die Experimente mit der genspezifischen siRNA unter UTP-Stimulation gezeigt haben. Für die Migration der Mesangiumzellen gilt darüber hinaus, dass auch das Produkt der Sphingosinkinase 1, Sphingosin-1-Phosphat, in der Lage ist, die Migration zu stimulieren. Im Gegensatz dazu spielt Sphingosin-1-Phosphat für die Induktion der Proliferation der hier verwendeten Zellen keine wesentliche Rolle. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass die Sphingosinkinase 1 und vorgeschaltet auch die neutrale Ceramidase bei der Migration von Mesangiumzellen eine zentrale Rolle spielen und damit als therapeutische Angriffspunkte bei der Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte Migration gekennzeichnet sind, in Frage kommen.

Differentiation and extracellular matrix interactions of chondrocytes in response to signaling molecules and biomaterials for cartilage repair = Differenzierung und Interaktionen von Chondrozyten mit der extrazellulären Matrix als Reaktion auf Signalmoleküle und Biomaterialien für die Wiederinstandsetzung von Knorpel

Chondrocytes live isolated in the voluminous extracellular matrix of cartilage, which they secrete and is neither vascularized nor innervated. Nutrient and waste exchanges occur through diffusion leading to low oxygen tension around the cells. Consequently even normal cartilage under normal physiological conditions suffers from a poor reparative potential that predisposes to degenerative conditions, such as osteoarthritis of the joints, with significant clinical effects.rnOne of the key challenges in medicine is the structural and functional replacement of lost or damaged tissues. Current therapeutical approaches are to transplant cells, implant bioartificial tissues, and chemically induce regeneration at the site of the injury. None of them reproduces well the biological and biomechanical properties of hyaline cartilage.rnThis thesis investigates the re-differentiation of chondrocytes and the repair of cartilage mediated by signaling molecules, biomaterials, and factors provided in mixed cellular cultures (co-culture systems). As signaling molecules we have applied prostaglandin E2 (PGE2) and bone morphogenetic protein 1 (BMP-1) and we have transfected chondrocytes with BMP-1 expressing vectors. Our biomaterials have been hydrogels of type-I collagen and gelatin-based scaffolds designed to mimic the architecture and biochemistry of native cartilage and provide a suitable three-dimensional environment for the cells. We have brought chondrocytes to interact with osteosarcoma Cal 72 cells or with murine preosteoblastic KS483 cells, either in a cell-to-cell or in a paracrine manner.rnExogenous stimulation with PGE2 or BMP-1 did not improve the differentiation or the proliferation of human articular chondrocytes. BMP-1 induced chondrocytic de-differentiation in a dose-dependent manner. Prostaglandin stimulation from gelatin-based scaffolds (three-dimensional culture) showed a certain degree of chondrocyte re-differentiaton. Murine preosteoblastic KS483 cells had no beneficial effect on human articular chondrocytes jointly cultivated with them in hydrogels of type I collagen. Although the hydrogels provided the chondrocytes with a proper matrix in which the cells adopted their native morphology; additionally, the expression of chondrocytic proteoglycan increased in the co-cultures after two weeks. The co-culture of chondrocytes with osteoblast-like cells (in transwell systems) resulted in suppression of the regular de-differentiation program that passaged chondrocytes undergo when cultured in monolayers. Under these conditions, the extracellular matrix of the chondrocytes, rich in type-II collagen and aggrecan, was not transformed into the extracellular matrix characteristic of de-differentiated human articular chondrocytes, which is rich in type-I collagen and versican.rnThis thesis suggests novel strategies of tissue engineering for clinical attempts to improve cartilage repair. Since implants are prepared in vitro (ex-vivo) by expanding human articular chondrocytes (autologous or allogeneic), we conclude that it will be convenient to provide a proper three-dimensional support to the chondrocytes in culture, to supplement the culture medium with PGE2, and to stimulate chondrocytes with osteoblastic factors by cultivating them with osteoblasts.rn

Extracellular glutamate-GABA balance in the developing neocortex

It has been shown in the study that glutamate transporters (EAAT) are capable to modulate GABA transports (GAT). Here we also report that DL-TBOA, a non-transportable glutamate uptake blocker, eliminates GAT-mediated GABA release, while D-aspartate, an EAAT substrate, does not block the latter. The strength or even the operating mode of GABA uptake/release could be influenced by the work of EAATs. Considering the interaction between EAATs and GATs we can conclude that ambient glutamate and GABA levels are mutually dependent. The EAAT-GAT crosstalk observed in this work is mediated by EAAT1 and GAT-2/3. Since both transporters are Na+ dependent and mainly glial, next we investigated the role of [Na+]i in astrocytic-mediated glutamate uptake. We tested whether [Na+]i changes affect paired-pulse plasticity of STCs recorded from cortical layer 2/3 astrocytes. We report that an elevation of [Na+]i induced either by using a high [Na+]i intrapipette solution or by application of GABA slows STCs kinetics and decrease paired-pulse facilitation (PPF) of STCs at short inter-stimulus intervals. Moreover, GAT inhibitors decrease PPF of STCs under control conditions, suggesting that endogenous GABA operating via GATs influences EAAT-mediated transport