Untersuchungen des Keratinfilament-Turnovers in lebenden Zellen

Das Zytoskelett eukaryotischer Zellen besteht aus drei verschiedenen Protein-Netzwerken: den Aktinfilamenten, Mikrotubuli und Intermediärfilamenten. Intermediärfilamente wurden ursprünglich als statische Strukturen angesehen, die die mechanische Stabilisierung der Zellen übernehmen. In den letzten Jahren hat sich dieses Bild jedoch geändert: Intermediärfilament-Netzwerke sind hochdynamisch und unterliegen kontinuierlichen Veränderungen, welche durch Phosphorylierungen reguliert werden. Sie interagieren mit anderen Zytoskelett-Proteinen und greifen in die Regulation von Schlüsselsignalwegen, die Zellwachstum und Zellteilung sowie Apoptose und Stressantwort bestimmen, ein. Die Mechanismen der Filamentplastizität konnten bisher jedoch nicht vollständig aufgeklärt werden. So ist beispielsweise unklar, wo Auf- und Abbau der Filamente stattfindet und welche Faktoren an der Netzwerkmodulation beteiligt sind. Ziel meiner Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung dieser Mechanismen am Beispiel der epithelialen Keratin-Intermediärfilamente zu leisten. Mit Hilfe von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen von fluoreszenzmarkierten Zellklonen wurden Nukleationszentren in der Zellperipherie identifiziert, in denen Keratinfilamentvorläufer gebildet werden. Es handelt sich dabei um fokale Adhäsionskomplexe, die als Anheftungsstellen zwischen der extrazellulären Matrix und dem intrazellulären Aktinfilament-System dienen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Filamentvorläufer-Entstehung für alle untersuchten Keratinisoformen gültig ist und in epitelialen als auch nicht-epithelialen Zelltypen abläuft. Knock-Down der Adhäsionskomponente Talin verhinderte die Keratinfilamentbildung. Modulation der fokalen Adhäsionskinase, die den Auf- und Abbau der Adhäsionskomplexe koordiniert, beeinflusste ebenso die Bildung der Keratinfilamentnetzwerke. Es konnte weiterhin beobachtet werden, dass die N-terminalen Isoformen IE und IF des Zytolinkers Plectin in fokalen Adhäsionen lokalisieren und damit möglicherweise an der Vernetzung von Keratinfilamentvorläufern, Zelladhäsionen und Aktinfilamenten beteiligt sind. Letztlich stellte sich heraus, dass die Bildung der Keratinfilamentvorläufer unabhängig von Proteintranslation ist. In den mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen wurde im Anschluss an die Keratinfilamentbildung ein kontinuierlicher zentripetaler Transport der wachsenden Vorläuferpartikel beobachtet. An Hand von pharmakologischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass dieser Transport Aktinfilament-abhängig ist. Zeitgleich kommt es zu Partikelfusion und Integration in das periphere Netzwerk, das sich weiterhin in Richtung auf das Zellzentrum bewegt. Mit Hilfe von Photoaktivierungsversuchen und Zellfusionsexperimenten konnte die Hypothese bestätigt werden, dass der Abbau der einwandernden Keratinfilamente in lösliche, rasch diffusible Zwischenstufen den kontinuierlichen peripheren Neuaufbau ermöglicht. Aus den Beobachtungen und bereits bekannten Ergebnissen wurde ein Modell des Keratin-Zyklus entwickelt, das die folgenden Stadien umfasst: Nukleation von Keratinfilamentvorläufern an fokalen Adhäsionen in der Zellperipherie, Elongation und Fusion der Keratinfilamentvorläufer bei zeitgleichem Aktinfilament-abhängigem zentripetalen Transport, Integration der Keratinfilamentvorläufer in das periphere Netzwerk, Bündelung der Filamente, Filamentabbau in lösliche Untereinheiten und Neubeginn des Zyklus in der Zellperipherie. Eine Störung dieses Zyklus liegt bei mutierten Keratinen vor, welche die Ursache von Blasen-bildenden Hauterkrankungen sind. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel von Keratin 6a-Mutanten, welche die Hauterkrankung Pachyonychia congenita verursachen, gezeigt, dass bei diesen Keratinen die Nukleation zwar im Bereich der Adhäsionskomplexe regelrecht abläuft, die anschließende Elongation und Netzwerkbildung aber gestört ist, so dass statt dessen kurzlebige, hyperphosphorylierte Granula entstehen. Der resultierende frustrane Keratin-Zyklus in der Zellperipherie ist stark beschleunigt und kann durch p38-Inhibierung gestoppt werden. Bei Proteasomeninhibierung wird der Zyklus in Richtung der Granulabildung verschoben. In dieser Arbeit wird erstmals das Keratin-Tretmühlen-Modell vorgestellt, das den regulierbaren Auf- und Abbau-Zyklus des Keratinnetzwerks beschreibt. Damit liegen testbare Hypothesen für die Aufklärung der Keratinfilament-Plastizität in physiologischen und pathologischen Situationen vor, die nach unseren ersten Ergebnissen auch von Relevanz für andere Intermediärfilamenttypen sind.

Etablierung transgener BY-2-Zelllinien zur In-vivo-Lokalisierung pflanzlicher Cytoskelettproteine

Bei den Pflanzen sind viele Fragen bezüglich der Organisation und Regulation des bei der Zellteilung und differenzierung wichtigen Auf-, Ab- und Umbaus des Mikrotubuli-Netzwerkes noch immer offen, insbesondere was die Rolle des γ-Tubulins betrifft. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von BY-2 Modell-Zelllinien (Nicotiana), die verschiedene mit fluoreszierenden Proteinen (FP) markierte Elemente des Cytoskeletts exprimieren, um eine fluoreszenzmikroskopische Detektion in vivo zu ermöglichen.rnAls Grundlage für alle weiteren Versuche wurde eine zuverlässige Methode zur A. tumefaciens vermittelten stabilen Transfektion von BY-2 Zellen erarbeitet. Für die Expression von FP-markierten Cytoskelettproteinen, wurden entsprechende Fusionskonstrukte kloniert und via A. tumefaciens in BY-2 Zellen transferiert. So gelang zunächst die Herstellung transgener Zelllinien, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimierten. Diese sollten später als Basis für die Untersuchung des dynamischen Mikrotubuli-Netzwerkes bzw. dessen Regulation dienen. In beiden Zelllinien standen die Konstrukte zunächst unter Kontrolle eines doppelten 35S-Promotors, was zu einer starken, konstitutiven Expression der Transgene führte. Fluoreszenzmikroskopisch konnten Strukturen, an deren Aufbau Mikrotubuli beteiligt sind, detektiert werden. Aufgrund einer starken Hintergrundfluoreszenz, vermutlich bedingt durch die konstitutive Überexpression, war die Darstellung feinerer Bereiche, wie sie im Cytoskelett häufig auftreten, jedoch äußerst schwierig. Deshalb wurde eine schwächere bzw. adäquate Expressionsrate angestrebt. rnPhysiologische Expressionsraten sollten vor allem durch den endogenen γ-Tubulin-Promotor ermöglicht werden. Da die entsprechende Sequenz noch unbekannt war, wurde sie zunächst bestimmt und in ein passendes Konstrukt integriert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der resultierenden Zelllinie ließen auf eine stark reduzierte Expressionsrate schließen. Tatsächlich war die Detektion von Cytoskelettstrukturen, wenn überhaupt, erst bei deutlich längeren Belichtungszeiten möglich. Bedingt durch die langen Belichtungszeiten wurde die Dokumentation durch eine latente pflanzentypische Autofluoreszenz der Zellen erschwert. Auch wenn hier keine detailreicheren Aufnahmen der Cytoskelettstrukturen möglich waren, ist die Zellkultur für weiterführende Untersuchungen, z.B. in Studien bezüglich des zeitlichen Expressionsmusters des γ-Tubulins, potentiell geeignet. Der Einsatz eines sensibleren Mikroskopsystems ist allerdings erforderlich. rnUm klären zu können, inwieweit γ-Tubulin mit den Mikrotubuli co-lokalisiert, wurden Zelllinien benötigt, bei denen die entsprechenden Elemente unterschiedlich markiert waren. Zu diesem Zweck wurde der Einsatz von RFP-markiertem Tubulin getestet. Eine deutliche Überexpression von RFP alleine war möglich. Trotz mehrfacher Wiederholung der Versuche war aber keine Expression von RFP-markiertem α-Tubulin in BY-2 Zellen zur Visualisierung der Mikrotubuli detektierbar. Die DNA-Sequenzen waren im Genom nachweisbar, eine Transkription jedoch nicht. Möglicherweise spielten hier gene silencing Effekte eine Rolle. Das verwendete RFP (TagRFP) und GFP stammten aus unterschiedlichen Organismen, aus einer Seeanemone bzw. einer Qualle. Eine Lösung könnte der Austausch des TagRFP durch ein Quallen-Derivat, das in einer von grün unterscheidbaren Farbe fluoresziert, bringen. Da bereits BY-2 Zelllinien vorliegen, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimieren, sollte es, nach Klonieren eines entsprechenden Konstruktes, zeitnah möglich sein, eine doppelt transfizierte Zelllinie herzustellen.