Die molekulare Evolution der Hämocyaninsuperfamilie der Arthropoden

In vielen Arthropoden wird Sauerstoff mittels des Kupferproteins Hämocyanin transportiert. In der vorliegenden Arbeit wurde das Hämocyanin einiger Vertreter der Arthropoden molekularbiologisch untersucht. Bei den Crustaceen (Homarus americanus und Palinurus elephas) konnten vier Untereinheiten isoliert werden, bei denen es sich um Hämocyanine des a-Typs handelt. Bei den Myriapoden (Chilopoda, Scutigera coleoptrata und Diplopoda, Spirostreptus spec.) konnten drei unterschiedliche Hämocyaninuntereinheiten gefunden werden. Erst seit einiger Zeit ist das Hämocyanin bei Myriapoden biochemisch charakterisiert und bei diesen Hämocyaninsequenzen handelt es sich um die ersten von Myriapoden. Bei den Onychophoren (Epiperipatus spec.) konnte ebenfalls erstmals ein Hämocyanin isoliert und sequenziert werden. Hierbei handelt es sich um den ersten Hinweis, dass Onychophoren über ein respiratorisches Protein verfügen. In einer phylogenetischen Analyse der Hämocyaninsequenzen konnte ein Stammbaum der Hämocyaninsuperfamilie erstellt werden. Innerhalb der Crustacea ordnen sich die verschiedenen Hämocyaninuntereinheiten in distinkten Ästen an. Die Hämocyanine der Myriapoda sind monophyletisch, wobei die Auftrennung in distinkte Untereinheiten bereits vor der Trennung der Chilopoden und Diplopoden erfolgte; die phylogenetische Stellung der Myriapoda kann anhand der Hämocyaninsequenzen nicht zuverlässig aufgelöst werden. Eine gemeinsame Anordnung mit den Hexapoda ('Tracheata'-Hypothese) kann jedoch mit hoher Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Onychophora stehen im Arthropodenstammbaum an basaler Position und können somit als Proarthropoda angesprochen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Hämocyaninevolution der Arthropodenevolution entspricht.

Charakterisierung von Arthropodenhämocyaninen

Verschiedene cDNA-Banken wurden erstellt, andere waren bereits vorhanden. Diese Expressionsbanken wurden mittels Antikörper- bzw. Sondenscreening auf Hämocyanin- bzw. bei den Insekten auch auf Hexamerinklone durchmustert. Dabei gelang es, diverse Hämocyaninunter-einheiten zu identifizieren und zu sequenzieren. Die erarbeiteten Sequenzen wurden im An-schluss für phylogenetische Studien benutzt. Es konnte hierbei gezeigt werden, dass die so-genannte „Tracheata-Hypothese“ immer unwahrscheinlicher wird. Diese geht von einer Schwestergruppenstellung der Hexapoda und der Myriapoda aus. Die hier gemachten Unter-suchungen widersprechen dieser Hypothese eindeutig. Die Ergebnisse stützen vielmehr die „Pancrustacea-Hypothese“. In den Stammbäumen sind die Crustaceenhämocyanine eindeutig in naher Verwandtschaft zu den paraphyletisch entstandenen Insektenhämocyaninen angeordnet. Ob die Crustaceen monophyletischen Ursprungs sind, kann nicht eindeutig beurteilt werden, es bestehen aber weiterhin begründete Zweifel. Die Myriapodenhämocyanine stehen in Schwestergruppenstellung zu den Crustaceen und den Insektenhämocyaninen. Dies weist auf ein gemeinsames Taxon der Mandibulata hin. Die systematische Stellung der Myriapoden innerhalb der Arthropoden kann allerdings nicht abschließend geklärt werden. Dazu ist eine weitergehende Aufklärung von Hämocyaninsequenzen in diesem Arthropodentaxon notwendig.

10 Å cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin and Limulus polyphemus hemocyanin

In the present study, the quaternary structures of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 and Limulus polyphemus hemocyanin, both proteins from the hemocyanin superfamily, were elucidated to a 10 Å resolution with the technique of cryo-EM 3D-reconstruction. Furthermore, molecular modelling and rigid-body fitting allowed a detailed insight into the cryo-EM structures at atomic level. The results are summarised as follows: Hexamerin 1. The cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 is the first quaternary structure of a protein from the group of the insect storage proteins. 2. The hexamerin LSP-2 is a hexamer of six bean-shaped subunits that occupy the corners of a trigonal antiprism, yielding a D3 (32) point-group symmetry. 3. Molecular modelling and rigid-body fitting of the hexamerin LSP-2 sequence showed a significant correlation between amino acid inserts in the primary structure and additional masses of the cryo-EM structure that are not present in the published quaternary structures of chelicerate and crustacean hemocyanins. 4. The cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 confirms that the arthropod hexameric structure is applicable to insect storage proteins. Hemocyanin 1. The cryo-EM structure of the 8×6mer Limulus polyphemus hemocyanin is the highest resolved quaternary structure of an oligo-hexameric arthropod hemocyanin so far. 2. The hemocyanin is build of 48 bean-shaped subunits which are arranged in eight hexamers, yielding an 8×6mer with a D2 (222) point-group symmetry. The 'basic building blocks' are four 2×6mers that form two 4×6mers in an anti-parallel manner, latter aggregate 'face-to-face' to the 8×6mer. 3. The morphology of the 8×6mer was gauged and described very precisely on the basis of the cryo-EM structure. 4. Based on earlier topology studies of the eight different subunit types of Limulus polyphemus hemocyanin, eleven types of interhexamer interfaces have been identified that in the native 8×6mer sum up to 46 inter-hexamer bridges - 24 within the four 2×6mers, 10 to establish the two 4×6mers, and 12 to assemble the two 4×6mers into an 8×6mer. 5. Molecular modelling and rigid-body fitting of Limulus polyphemus and orthologous Erypelma californicum sequences allowed to assign very few amino acids to each of these interfaces. These amino acids now serve as candidates for the chemical bonds between the eight hexamers. 6. Most of the inter-hexamer contacts are conspicuously histidine-rich and evince constellations of amino acids that could constitute the basis for the allosteric interactions between the hexamers. 7. The cryo-EM structure of Limulus polyphemus hemocyanin opens the door to a fundamental understanding of the function of this highly cooperative protein.