Entwicklung und Tests von Algorithmen für die Impedanztomographie

Die Elektrische Impedanztomographie soll als kostengünstige und nebenwirkungsfreie Tomographiemethode in der medizinischen Diagnostik, z. B. in der Mammographie dienen. Mit der EIT läßt sich Krebsgewebe von gesundem Gewebe unterscheiden, da es eine signifikant erhöhte Leitfähigkeit aufweist. Damit kann die EIT als Ergänzung zu den klassischen Diagnoseverfahren dienen. So ist z.B. bei jungen Frauen mit einem dichteren Fettgewebe die Identifizierung eines Mammakarzinoms mit der Röntgentomographie nicht immer möglich. Ziel dieser Arbeit war es, einen Prototypen für die Impedanztomographie zu entwickeln und mögliche Anwendungen zu testen. Der Tomograph ist in Zusammenarbeit mit Dr. K.H.Georgi gebaut worden. Der Tomograph erlaubt es niederohmige, Wechselströme an Elektroden auf der Körperoberfläche einzuspeisen. Die Potentiale können an diesen Elektroden programmierbar vorgegeben werden. Weitere hochohmige Elektroden dienen zur Potentialmessung. Um den Hautwiderstand zu überbrücken, werden Wechselstromfrequenzen von 20-100 kHz eingesetzt. Mit der Möglichkeit der Messung von Strom und Potential auf unterschiedlichen Elektroden kann man das Problem des nur ungenau bekannten Hautwiderstandes umgehen. Prinzipiell ist es mit dem Mainzer EIT System möglich, 100 Messungen in der Sekunde durchzuführen. Auf der Basis von mit dem Mainzer EIT gewonnenen Daten sollten unterschiedliche Rekonstruktionsalgorithmen getestet und weiterentwickelt werden. In der Vergangenheit sind verschiedene Rekonstruktionsalgorithmen für das mathematisch schlecht gestellte EIT Problem betrachtet worden. Sie beruhen im Wesentlichen auf zwei Strategien: Die Linearisierung und iterative Lösung des Problems und Gebietserkennungsmethoden. Die iterativen Verfahren wurden von mir dahingehend modifiziert, dass Leitfähigkeitserhöhungen und Leitfähigkeitserniedrigungen gleichberechtigt behandelt werden können. Für den modifizierten Algorithmus wurden zwei verschiedene Rekonstruktionsalgorithmen programmiert und mit synthetischen Daten getestet. Zum einen die Rekonstruktion über die approximative Inverse, zum anderen eine Rekonstruktion mit einer Diskretisierung. Speziell für die Rekonstruktion mittels Diskretisierung wurde eine Methode entwickelt, mit der zusätzliche Informationen in der Rekonstruktion berücksichtigt werden können, was zu einer Verbesserung der Rekonstruktion beiträgt. Der Gebietserkennungsalgorithmus kann diese Zusatzinformationen liefern. In der Arbeit wurde ein neueres Verfahren für die Gebietserkennung derart modifiziert, dass eine Rekonstruktion auch für getrennte Strom- und Spannungselektroden möglich wurde. Mit Hilfe von Differenzdaten lassen sich ausgezeichnete Rekonstruktionen erzielen. Für die medizinischen Anwendungen sind aber Absolutmessungen nötig, d.h. ohne Leermessung. Der erwartende Effekt einer Inhomogenität in der Leitfähigkeit ist sehr klein und als Differenz zweier grosser Zahlen sehr schwierig zu bestimmen. Die entwickelten Algorithmen kommen auch gut mit Absolutdaten zurecht.

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Functional characterization of the placenta specific protein PLAC1 and its use for cancer immunotherapy

Summary Antibody-based cancer therapies have been successfully introduced into the clinic and have emerged as the most promising therapeutics in oncology. The limiting factor regarding the development of therapeutical antibody vaccines is the identification of tumor-associated antigens. PLAC1, the placenta-specific protein 1, was categorized for the first time by the group of Prof. Sahin as such a tumor-specific antigen. Within this work PLAC1 was characterized using a variety of biochemical methods. The protein expression profile, the cellular localization, the conformational state and especially the interacting partners of PLAC1 and its functionality in cancer were analyzed. Analysis of the protein expression profile of PLAC1 in normal human tissue confirms the published RT-PCR data. Except for placenta no PLAC1 expression was detectable in any other normal human tissue. Beyond, an increased PLAC1 expression was detected in several cancer cell lines derived of trophoblastic, breast and pancreatic lineage emphasizing its properties as tumor-specific antigen. rnThe cellular localization of PLAC1 revealed that PLAC1 contains a functional signal peptide which conducts the propeptide to the endoplasmic reticulum (ER) and results in the secretion of PLAC1 by the secretory pathway. Although PLAC1 did not exhibit a distinct transmembrane domain, no unbound protein was detectable in the cell culture supernatant of overexpressing cells. But by selective isolation of different cellular compartments PLAC1 was clearly enriched within the membrane fraction. Using size exclusion chromatography PLAC1 was characterized as a highly aggregating protein that forms a network of high molecular multimers, consisting of a mixture of non-covalent as well as covalent interactions. Those interactions were formed by PLAC1 with itself and probably other cellular components and proteins. Consequently, PLAC1 localize outside the cell, where it is associated to the membrane forming a stable extracellular coat-like structure.rnThe first mechanistic hint how PLAC1 promote cancer cell proliferation was achieved identifying the fibroblast growth factor FGF7 as a specific interacting partner of PLAC1. Moreover, it was clearly shown that PLAC1 as well as FGF7 bind to heparin, a glycosaminoglycan of the ECM that is also involved in FGF-signaling. The participation of PLAC1 within this pathway was approved after co-localizing PLAC1, FGF7 and the FGF7 specific receptor (FGFR2IIIb) and identifying the formation of a trimeric complex (PLAC1, FGF7 and the specific receptor FGFR2IIIb). Especially this trimeric complex revealed the role of PLAC1. Binding of PLAC1 together with FGF7 leads to the activation of the intracellular tyrosine kinase of the FGFR2IIIb-receptor and mediate the direct phosphorylation of the AKT-kinase. In the absence of PLAC1, no FGF7 mediated phosphorylation of AKT was observed. Consequently the function of PLAC1 was clarified: PLAC1 acts as a co-factor by stimulating proliferation by of the FGF7-FGFR2 signaling pathway.rnAll together, these novel biochemical findings underline that the placenta specific protein PLAC1 could be a new target for cancer immunotherapy, especially considering its potential applicability for antibody therapy in tumor patients.