Kontaktmechanik und Strukturierung von festkörperunterstützen Lipidmembranen

Die vorliegende Arbeit beschreibt unter anderem die Realisierung eines Assays aus mikrostrukturierten und selektiv funktionalisierten künstlichen Membransegmenten auf einem Chip. Die Strukturierungsmethode kombiniert die softlithographische Technik des Mikroformens in Kapillaren mit der Vesikelspreittechnik und bietet ein elegantes Verfahren, einzeln adressierbare Lipidsegmente im Mikrometer Regime zu erzeugen. Unter Berücksichtigung des hydrodynamischen Fließverhaltens und der Stabilitätskriterien für PDMS-Elastomere wurden außerdem neue Strukturen entwi-ckelt, die für den kombinierten Einsatz von Rasterkraftmikroskopie und Fluoreszenz-mikroskopie optimiert sind. Die Anwendbarkeit des Lab-On-A-Chip-Devices als Bio-sensor wurde durch zwei prominente Protein-Rezeptor-Bindungsstudien fluores-zenzmikroskopisch und rasterkraftmikroskopisch belegt. Im zweiten Teil der Arbeit sind die mechanischen und adhäsiven Eigenschaften aus-gewählter Lipidsysteme mit einer neuen Charakterisierungstechnik untersucht wor-den, die die Kontaktmechanik von Rastersonden und Lipidmembranen auf Basis der Digitalisierung von Hochgeschwindigkeitskraftkurven und einer automatisierten Multi-parameteranalyse quantitativ erfasst. Dabei konnte die Korrelation zwischen der Ad-häsion und den materialspezifischen Durchbruchlängen und Durchbruchkräften, die charakteristische Stabilitätsparameter der Lipidmembran darstellen, auf Systemen mit variierenden Kopfgruppen und Kettenlängen analysiert werden. Das Verfahren erlaubte zudem die simultane Quantifizierung der elastischen Eigenschaften der Li-piddoppelschichten. Zu den Kraftkurven wurden Simulationen der Systemantwort durchgeführt, die ein tieferes Verständnis der Kontrastentstehung ermöglichen.

Multiplex-Genotypisierung forensisch relevanter SNPs unter Verwendung von Microarrays auf chemisch aktivierten Glasflächen

Die Analyse tandem-repetitiver DNA-Sequenzen hat einen festen Platz als genetisches Typisierungsverfahren in den Breichen der stammesgeschichtlichen Untersuchung, der Verwandtschaftsanalyse und vor allem in der forensischen Spurenkunde, bei der es durch den Einsatz der Multiplex-PCR-Analyse von Short Tandem Repeat-Systemen (STR) zu einem Durchbruch bei der Aufklärung und sicheren Zuordnung von biologischen Tatortspuren kam. Bei der Sequenzierung des humanen Genoms liegt ein besonderes Augenmerk auf den genetisch polymorphen Sequenzvariationen im Genom, den SNPs (single nucleotide polymorphisms). Zwei ihrer Eigenschaften – das häufige Vorkommen innerhalb des humanen Genoms und ihre vergleichbar geringe Mutationsrate – machen sie zu besonders gut geeigneten Werkzeugen sowohl für die Forensik als auch für die Populationsgenetik.rnZum Ziel des EU-Projekts „SNPforID“, aus welchem die vorliegende Arbeit entstanden ist, wurde die Etablierung neuer Methoden zur validen Typisierung von SNPs in Multiplexverfahren erklärt. Die Berücksichtigung der Sensitivität bei der Untersuchung von Spuren sowie die statistische Aussagekraft in der forensischen Analyse standen dabei im Vordergrund. Hierfür wurden 52 autosomale SNPs ausgewählt und auf ihre maximale Individualisierungsstärke hin untersucht. Die Untersuchungen der ersten 23 selektierten Marker stellen den ersten Teil der vorliegenden Arbeit dar. Sie umfassen die Etablierung des Multiplexverfahrens und der SNaPshot™-Typisierungsmethode sowie ihre statistische Auswertung. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind ein Teil der darauf folgenden, in enger Zusammenarbeit der Partnerlaboratorien durchgeführten Studie der 52-SNP-Multiplexmethode. rnEbenfalls im Rahmen des Projekts und als Hauptziel der Dissertation erfolgten Etablierung und Evaluierung des auf der Microarray-Technologie basierenden Verfahrens der Einzelbasenverlängerung auf Glasobjektträgern. Ausgehend von einer begrenzten DNA-Menge wurde hierbei die Möglichkeit der simultanen Hybridisierung einer möglichst hohen Anzahl von SNP-Systemen untersucht. Die Auswahl der hierbei eingesetzten SNP-Marker erfolgte auf der Basis der Vorarbeiten, die für die Etablierung des 52-SNP-Multiplexes erfolgreich durchgeführt worden waren. rnAus einer Vielzahl von Methoden zur Genotypisierung von biallelischen Markern hebt sich das Assay in seiner Parallelität und der Einfachheit des experimentellen Ansatzes durch eine erhebliche Zeit- und Kostenersparnis ab. In der vorliegenden Arbeit wurde das „array of arrays“-Prinzip eingesetzt, um zur gleichen Zeit unter einheitlichen Versuchsbedingungen zwölf DNA-Proben auf einem Glasobjektträger zu typisieren. Auf der Basis von insgesamt 1419 typisierten Allelen von 33 Markern konnte die Validierung mit einem Typisierungserfolg von 86,75% abgeschlossen werden. Dabei wurden zusätzlich eine Reihe von Randbedingungen in Bezug auf das Sonden- und Primerdesign, die Hybridisierungsbedingungen sowie physikalische Parameter der laserinduzierten Fluoreszenzmessung der Signale ausgetestet und optimiert. rn

Radiomarkierung von HPMA-basierten, funktionalisierten Polymeren mit metallischen Radionukliden für die medizinische Anwendung als Theranostika

Für eine erfolgreiche Behandlung bösartiger Tumore ist eine frühzeitige Diagnose, aber auch eine effektive und effiziente Therapie essentiell. In diesem Zusammenhang sind Nanomaterialien in den Fokus der Arzneimittelentwicklung gerückt, welche für Diagnostik und Therapie genutzt werden könnten.rnSystematische Studien zur Radiometallmarkierung von Nanopartikeln und deren Stabilität in vitro im Zusammenhang mit der Struktur des Linkers und dem Anteil an Chelator wurden anhand verschiedener HPMA-DOTA-Konjugate durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Linkerstruktur und der Belegungsgrad sowohl die Markierung als auch die in vitro -Stabilität von radiometallmarkierten HPMA-rnDOTA-Konjugaten beeinflussen.rnFür die Markierung selbst stehen mehrere Generator-produzierte metallische Positronenemitter zur Verfügung. Infolge der gesetzlichen Bestimmungen muss das Eluat der Generatoren bestimmte Spezifikationen (Elutionsausbeute, Durchbruch des Mutternuklids, Gehalt an Fremdionen, pH-Wert etc.) erfüllen, um für die Darstellung von Radiopharmaka verwendet werden zu können.rnFür das bereits etablierte PET-Nuklid 68Ga konnte eine Ethanol-basierte Aufreinigung entwickelt werden, welche hohe Elutions- und Markierungsausbeuten sowie Radionuklidreinheit garantiert und damit einen wichtigen Schritt für die Entwicklung von Kit-Formulierungen repräsentiert. Ausserdem konnten zwei Methoden zur Qualitätskontrolle entwickelt werden, welche es ermöglichen die Radionuklidreinheit des initialen 68Ga-Eluats, aber auch des finalen 68Ga-Radiopharmakons innerhalb einer Stunde ohne γ–Spektroskopie zu bestimmen.rnWährend mit 68Ga die Pharmakokinetik markierter Derivate für einen Zeitraum von bis 3 Stunden zugänglich ist, deckt das Generator-produzierte 44Sc eine Periode von bis zu einem Tag ab. Damit lässt sich die Pharmakokinetik markierter polymerer Drug Carrier-Systeme – von der frühen Ausscheidungsphase bis hin zu organspezifischen Akkumulationen durch passives und aktives Targeting – gut beschreiben.rnFür 44Sc konnte anhand der Modellverbindung DOTATOC gezeigt werden, dass das aufgereinigte Generatoreluat für die Markierung mit hohen radiochemischen Ausbeuten geeignet ist und etablierte Markierungsmethoden übertragbar sind. In weiterführenden Studien zur molekularen Bildgebung könnte das Potential dieses PET-Nuklids für die Langzeitbildgebung gezeigt werden.

Imaging and modeling of pore scale processes in porous media using X-ray computed tomography and lattice Boltzmann solver

In der Erdöl– und Gasindustrie sind bildgebende Verfahren und Simulationen auf der Porenskala im Begriff Routineanwendungen zu werden. Ihr weiteres Potential lässt sich im Umweltbereich anwenden, wie z.B. für den Transport und Verbleib von Schadstoffen im Untergrund, die Speicherung von Kohlendioxid und dem natürlichen Abbau von Schadstoffen in Böden. Mit der Röntgen-Computertomografie (XCT) steht ein zerstörungsfreies 3D bildgebendes Verfahren zur Verfügung, das auch häufig für die Untersuchung der internen Struktur geologischer Proben herangezogen wird. Das erste Ziel dieser Dissertation war die Implementierung einer Bildverarbeitungstechnik, die die Strahlenaufhärtung der Röntgen-Computertomografie beseitigt und den Segmentierungsprozess dessen Daten vereinfacht. Das zweite Ziel dieser Arbeit untersuchte die kombinierten Effekte von Porenraumcharakteristika, Porentortuosität, sowie die Strömungssimulation und Transportmodellierung in Porenräumen mit der Gitter-Boltzmann-Methode. In einer zylindrischen geologischen Probe war die Position jeder Phase auf Grundlage der Beobachtung durch das Vorhandensein der Strahlenaufhärtung in den rekonstruierten Bildern, das eine radiale Funktion vom Probenrand zum Zentrum darstellt, extrahierbar und die unterschiedlichen Phasen ließen sich automatisch segmentieren. Weiterhin wurden Strahlungsaufhärtungeffekte von beliebig geformten Objekten durch einen Oberflächenanpassungsalgorithmus korrigiert. Die Methode der „least square support vector machine” (LSSVM) ist durch einen modularen Aufbau charakterisiert und ist sehr gut für die Erkennung und Klassifizierung von Mustern geeignet. Aus diesem Grund wurde die Methode der LSSVM als pixelbasierte Klassifikationsmethode implementiert. Dieser Algorithmus ist in der Lage komplexe geologische Proben korrekt zu klassifizieren, benötigt für den Fall aber längere Rechenzeiten, so dass mehrdimensionale Trainingsdatensätze verwendet werden müssen. Die Dynamik von den unmischbaren Phasen Luft und Wasser wird durch eine Kombination von Porenmorphologie und Gitter Boltzmann Methode für Drainage und Imbibition Prozessen in 3D Datensätzen von Böden, die durch synchrotron-basierte XCT gewonnen wurden, untersucht. Obwohl die Porenmorphologie eine einfache Methode ist Kugeln in den verfügbaren Porenraum einzupassen, kann sie dennoch die komplexe kapillare Hysterese als eine Funktion der Wassersättigung erklären. Eine Hysterese ist für den Kapillardruck und die hydraulische Leitfähigkeit beobachtet worden, welche durch die hauptsächlich verbundenen Porennetzwerke und der verfügbaren Porenraumgrößenverteilung verursacht sind. Die hydraulische Konduktivität ist eine Funktion des Wassersättigungslevels und wird mit einer makroskopischen Berechnung empirischer Modelle verglichen. Die Daten stimmen vor allem für hohe Wassersättigungen gut überein. Um die Gegenwart von Krankheitserregern im Grundwasser und Abwässern vorhersagen zu können, wurde in einem Bodenaggregat der Einfluss von Korngröße, Porengeometrie und Fluidflussgeschwindigkeit z.B. mit dem Mikroorganismus Escherichia coli studiert. Die asymmetrischen und langschweifigen Durchbruchskurven, besonders bei höheren Wassersättigungen, wurden durch dispersiven Transport aufgrund des verbundenen Porennetzwerks und durch die Heterogenität des Strömungsfeldes verursacht. Es wurde beobachtet, dass die biokolloidale Verweilzeit eine Funktion des Druckgradienten als auch der Kolloidgröße ist. Unsere Modellierungsergebnisse stimmen sehr gut mit den bereits veröffentlichten Daten überein.

Neuartige kryogene Penning-Falle für den Nachweis von Spin-Übergängen eines Protons und Bestimmung seines g-Faktors

In dieser Arbeit wird der Entwurf, der Aufbau, die Inbetriebnahme und die Charakterisierung einer neuartigen Penning-Falle im Rahmen des Experiments zur Bestimmung des g-Faktors des Protons präsentiert. Diese Falle zeichnet sich dadurch aus, dass die Magnetfeldlinien eines äußeren homogenen Magnetfeldes durch eine ferromagnetische Ringelektrode im Zentrum der Falle verzerrt werden. Der inhomogene Anteil des resultierenden Magnetfeldes, die sogenannte magnetische Flasche, lässt sich durch den Koeffizient B2 = 297(10) mT/mm2 des Terms zweiter Ordnung der Ortsabhängigkeit des Feldes quantifizieren. Eine solche ungewöhnlich starke Feldinhomogenität ist Grundvoraussetzung für den Nachweis der Spinausrichtung des Protons mittels des kontinuierlichen Stern-Gerlach-Effektes. Dieser Effekt basiert auf der im inhomogenen Magnetfeld entstehenden Kopplung des Spin-Freiheitsgrades des gefangenen Protons an eine seiner Eigenfrequenzen. Ein Spin-Übergang lässt sich so über einen Frequenzsprung detektieren. Dabei ist die nachzuweisende Änderung der Frequenz proportional zu B2 und zum im Fall des Protons extrem kleinen Verhältnis zwischen seinem magnetischen Moment nund seiner Masse. Die durch die benötigte hohe Inhomogenität des Magnetfeldes bedingten technischen Herausforderungen erfordern eine fundierte Kenntnis und Kontrolle der Eigenschaften der Penning-Falle sowie der experimentellen Bedingungen. Die in der vorliegenden Arbeit entwickelte Penning-Falle ermöglichte den erstmaligen zerstörungsfreien Nachweis von Spin-Quantensprüngen eines einzelnen gefangenen Protons, was einen Durchbruch für das Experiment zur direkten Bestimmung des g-Faktors mit der angestrebten relativen Genauigkeit von 10−9 darstellte. Mithilfe eines statistischen Verfahrens ließen sich die Larmor- und die Zyklotronfrequenz des Protons im inhomogenen Magnetfeld der Falle ermitteln. Daraus wurde der g-Faktor mit einer relativen Genauigkeit von 8,9 × 10−6 bestimmt. Die hier vorgestellten Messverfahren und der experimentelle Aufbau können auf ein äquivalentes Experiment zur Bestimmung des g-Faktors des Antiprotons zum Erreichen der gleichen Messgenauigkeit übertragen werden, womit der erste Schritt auf dem Weg zu einem neuen zwingenden Test der CPT-Symmetrie im baryonischen Sektor gemacht wäre.

Entwicklung einer Kryokonservierungsmethode für Spermien der Honigbiene, Apis mellifera

Die westliche Honigbiene (Apis mellifera) ist von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung. Seit Jahren zeichnen sich in Nordamerika sowie in manchen Teilen Europas rückläufige Bienenvölkerzahlen und eine abnehmende Artenvielfalt innerhalb der Bienenfamilie ab. Mittlerweile ist von einer globalen Bestäuberkrise die Rede und es wird verstärkt nach Möglichkeiten gesucht, um dieser Krise entgegenzuwirken. Eine Konservierung von Bienenspermien in flüssigem Stickstoff ohne Fruchtbarkeitsreduzierung würde die Bienenzucht revolutionieren und stark beschleunigen, da räumliche und zeitliche Restriktionen bei der Wahl des Bienenspermas wegfielen. Zudem wäre eine Möglichkeit zur Sicherung der genetischen Diversität geschaffen. Im Rahmen des hier vorgestellten Projektes wurde eine solche Methode erarbeitet. In umfangreichen Abkühl- und Einfrierversuchen konnte eine neue Konservierungstechnik entwickelt werden, bei der das Kryoprotektivum mittels Dialyse dem Bienensperma zugesetzt wird. Dieses Verfahren erhält die native Spermaform, in der die Spermien parallel und inaktiv in dicht gepackten Clustern vorliegen, und erzielt bisher unerreichte Besamungserfolge. So konnten durchschnittlich 1,25 Mio. Spermien in den Spermatheken besamter Königinnen gezählt werden und davon waren ungefähr 90% motil. Besonders vielversprechend ist jedoch, dass 79,4% der Brut weiblich waren. Ein so hoher Anteil weiblicher Brut konnte bislang nicht erreicht werden und wäre für züchterische Zwecke ausreichend.