On the cellular stress response to Staphylococcus aureus alpha-toxin

Staphylococcus aureus alpha-hemolysin was the first bacterial toxin recognized to form pores in the plasma membrane of eukaryotic cells. It is secreted as a water-soluble monomer that upon contact with target membranes forms an amphiphatic heptameric beta-barrel which perforates the bilayer. As a consequence, red cells undergo colloidosmotic lyses, while some nucleated cells may succumb to necrosis or programmed cell death. However, most cells are capable of repairing a limited number of membrane lesions, and then respond with productive transcriptional activation of NF-kB. In the present study, by using microarray and semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), data from a previously performed serial analysis of gene expression (SAGE) were extended and verified, revealing that immediate early genes (IEGs) such as c-fos, c-jun and egr-1 are strongly induced at 2-8 h after transient toxin treatment. Activating protein 1 (AP-1: c-Fos, c-Jun) binding activity was increased accordingly. As IEGs are activated by growth factors, these findings led to the discovery that -toxin promotes cell cycle progression of perforated cells in an EGFR-dependent fashion. Although the amount of c-fos mRNA rose rapidly after toxin treatment, c-Fos protein expression was observed only after a lag of about 3 h. Since translation consumes much ATP, which transiently drops after transient membrane perforation, the suspicion arised that membrane-perforation caused global, but temporary downregulation of translation. In fact, eIF2α became heavily phosphorylated minutes after cells had been confronted with the toxin, resulting in shutdown of protein synthesis before cellular ATP levels reached the nadir. GCN2 emerged as a candidate eIF2α kinase, since its expression rapidly increased in toxin-treated cells. Two hours after toxin treatment, GADD34 transcripts, encoding a protein that targets the catalytic subunit of protein phosphatase 1 (PP1) to the endoplasmic reticulum, were overexpressed. This was followed by dephosphorylation of eIF2α and resumption of protein synthesis. Addition of tautomycetin, a specific inhibitor of PP1, led to marked hyperphosphorylation of eIF2α and significantly reduced the drop of ATP-levels in toxin-treated cells. A novel link between two major stress-induced signalling pathways emerged when it was found that both translational arrest and restart were under the control of stress-activated protein kinase (SAPK) p38. The data provide an explanation for the indispensible role of p38 for defence against the archetypal threat of membrane perforation by agents that produce small transmembrane-pores.

Die Verbindung von Kleinwinkelstreuung und in silico-Methodik zur Aufklärung von Konformationswechseln großer Proteinkomplexe

In dieser Dissertation wurden die Methoden Homologiemodellierung und Molekulardynamik genutzt, um die Struktur und das Verhalten von Proteinen in Lösung zu beschreiben. Mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung wurden die mit den Computermethoden erzeugten Vorhersagen verifiziert. Für das alpha-Hämolysin, ein Toxin von Staphylococcus aureus, das eine heptamere Pore formen kann, wurde erstmalig die monomere Struktur des Protein in Lösung beschrieben. Homologiemodellierung auf Basis verwandter Proteine, deren monomere Struktur bekannt war, wurde verwendet, um die monomere Struktur des Toxins vorherzusagen. Flexibilität von Strukturelementen in einer Molekulardynamiksimulation konnte mit der Funktionalität des Proteines korreliert werden: Intrinsische Flexibilität versetzt das Protein in die Lage den Konformationswechsel zur Pore nach Assemblierung zu vollziehen. Röntgenkleinwinkelstreuung bewies die Unterschiede der monomeren Struktur zu den Strukturen der verwandten Proteine und belegt den eigenen Vorschlag zur Struktur. Überdies konnten Arbeiten an einer Mutante, die in einer sogenannten Präporenkonformation arretiert und nicht in der Lage ist eine Pore zu formen, zeigen, dass dieser Übergangszustand mit der Rotationsachse senkrecht zur Membran gelagert ist. Eine geometrische Analyse beweist, dass es sterisch möglich ist ausgehend von dieser Konformation die Konformation der Pore zu erreichen. Eine energetische und kinetische Analyse dieses Konformationswechsels steht noch aus. Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit den Konformationswechseln von Hämocyaninen. Diese wurden experimentell mittels Röntgenkleinwinkelstreuung verfolgt. Konformationswechsel im Zusammenhang mit der Oxygenierung konnten für die 24meren Hämocyanine von Eurypelma californicum und Pandinus imperator beschrieben werden. Für eine Reihe von Hämocyaninen ist nachgewiesen, dass sie unter Einfluss des Agenz SDS Tyrosinaseaktivität entfalten können. Der Konformationswechsel der Hämocyanine von E. californicum und P. imperator bei der Aktivierung zur Tyrosinase mittels SDS wurde experimentell bestätigt und die Stellung der Dodekamere der Hämocyanine als wesentlich bei der Aktivierung festgestellt. Im Zusammenhang mit anderen Arbeiten gilt damit die Relaxierung der Struktur unter SDS-Einfluss und der sterische Einfluss auf die verbindenden Untereinheiten b & c als wahrscheinliche Ursache für die Aktivierung zur Tyrosinase. Eigene Software zum sogenannten rigid body-Modellierung auf der Basis von Röntgenkleinwinkelstreudaten wurde erstellt, um die Streudaten des hexameren Hämocyanins von Palinurus elephas und Palinurus argus unter Einfluss der Effektoren Urat und Koffein strukturell zu interpretieren. Die Software ist die erste Implementierung eines Monte Carlo-Algorithmus zum rigid body-Modelling. Sie beherrscht zwei Varianten des Algorithmus: In Verbindung mit simulated annealing können wahrscheinliche Konformationen ausgefiltert werden und in einer anschließenden systematischen Analyse kann eine Konformation geometrisch beschrieben werden. Andererseits ist ein weiterer, reiner Monte Carlo-Algorithmus in der Lage die Konformation als Dichteverteilung zu beschreiben.

Escherichia coli alpha-Hämolysin: Untersuchungen zur Struktur und Porenbildung

Escherichia coli α-Hämolysin (HlyA) ist ein Prototyp der RTX-Toxine, die zu den α-porenbildenden Toxinen gehören. HlyA bildet Poren in einer Vielzahl eukaryontischer Zielzellen. Das 107 kDa große Protein besteht aus 1024 Aminosäuren, die gemeinsam mit den Proteinen für posttranslationale Modifikation und Sekretion in einem Operon codiert werden. Die N-terminale Hälfte von HlyA besteht aus mehreren amphipathischen α –Helices, die mit der Porenbildung assoziiert werden, gefolgt von der Calcium-bindenden RTX-Domäne in der C-terminalen Hälfte des Moleküls. Über den porenbildenen Mechanismus ist wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit fokussierte sich auf die Frage, ob dieser Prozess eine Oligomerisierung mehrerer HlyA-Moleküle beinhaltet, oder ob die membranschädigende Struktur von einem Monomer gebildet wird. Drei unabhängige biochemische Methoden wurden in dem Versuch eingesetzt, HlyA-Oligomere in permeabilisierten Membranen zu detektieren. In allen drei Ansätzen wurden negative Ergebnisse erreicht, was das Konzept bestätigt, dass die Pore von HlyA von einem Monomer gebildet wird. PCR-basierte Cysteinsubstitutionen wurden durchgeführt, um den N-terminus von HlyA zu charakterisieren. Einzelne Cysteinreste wurden an 21 Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz 13-55 eingeführt, und mit dem umgebungssensitiven Fluorophor Badan markiert. Spektrofluorimetrische Messungen zeigten, dass alle untersuchten Aminosäuren innerhalb dieser Domäne unabhängig von der porenbildenden Aktivität in die Membran inserieren. Deletionen der Aminosäuren 1-50 hatten keinen Einfluß auf die lytische Aktivität, während die Deletion der Aminosäuren 1-100 in einer fast vollständig inaktiven Toxinmutante resultierte. Die Einführung von Prolinen durch PCR-basierte Mutagenese wurde durchgeführt, um die Beteiligung vorhergesagter α-Helices innerhalb der N-terminalen Hälfte von HlyA an der hämolytischen Aktivität zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Struktur von mindestens vier vorhergesagten Helices bedeutend für die hämolytische Aktivität ist.