Regulation der Selenoproteinsynthese durch den Mevalonatweg

Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss des Mevalonatpfads auf die Expression von Selenoproteinen untersucht werden. Im Mevalonatpfad, einem universellen Stoffwechselweg eukaryontischer Zellen, entstehen neben Cholesterol auch verschiedene Isoprenoide, die z.B. für die post-transkriptionelle Modifikation der Selenocystein-tRNA herangezogen werden. Selenocystein ist funktioneller Bestandteil von Selenoproteinen, welche häufig in den Abbau von oxidativem Stress involviert sind. rnDer Mevalonatpfad wird hauptsächlich durch die HMG-CoA-Reduktase (HMGCR) reguliert. Pharmaka vom „Statin“-Typ gelten als wirkungsvolle kompetitive Inhibitoren dieses Enzyms und finden ihren Einsatz bei Patienten zur Behandlung von Hypercholesterolämie, welche eine Grundlage für vaskuläre Krankheiten bildet. Trotz der allgemein guten Verträglichkeit der Statine treten jedoch auch unerwünschte Nebeneffekte, wie Erhöhung der Leberenzyme oder Myopathien auf, deren biochemischer Hintergrund bislang noch im Dunkeln liegt. rnDie in dieser Arbeit durchgeführten Experimente belegen, dass Atorvastatin, Cerivastatin und Lovastatin in klinisch relevanten Dosen die Synthese bestimmter Selenoproteine, wie der Glutathionperoxidase (GPx), in klonalen humanen Hepatocyten post-transkriptionell unterdrücken, wodurch die Zellen anfälliger für oxidativen Stress in Form von Peroxiden werden. Dieser Mechanismus könnte eine Erklärung für die häufig beobachteten abnormen Leberwerte von Statin-behandelten Patienten darstellen.rnEndogenes Cholesterol gilt ebenfalls als potenter Inhibitor der HMGCR. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass Cholesterol in verschiedenen Formen, als Low-Density-Lipoprotein (LDL), als 25-Hydroxycholesterol, und als Methylcyclodextrin-Komplex in unterschiedlichen humanen Zelltypen die Selenoproteinsynthese ebenfalls unterdrücken. Der negative Zusammenhang zwischen Cholesterol und bestimmten Selenoproteinen konnte auch in vivo beobachtet werden. In juvenilen Mäusen konnte gezeigt werden, dass ein Knockout des LDL-Rezeptors sowie auch ein Knockout von Apolipoprotein E zu einer Senkung des Lebercholesterols führte, was in einer Zunahme der GPx in der Leber resultierte.rnDie vorliegenden Daten belegen erstmals einen direkten und funktionellen Zusammenhang zwischen dem Mevalonatpfad und der Selenoproteinsynthese. Unterdrückung dieses Pfades, entweder durch exogene Substanzen wie Statine, oder durch endogene Substanzen wie Cholesterol, hat offenbar zur Folge, dass essentielle Zwischenprodukte für die Modifizierung der Selenocystein-tRNA fehlen, was in einer post-transkriptionellen Verminderung der induzierbaren Selenoproteine resultiert. Dies könnte die biochemische Grundlage für einen Teil der vielfältigen gesundheitlich negativen Auswirkungen schon geringfügig erhöhter Cholesterolspiegel sein.

Effects of glucocorticoids on vascular NADPH oxidases and endothelial NO synthase

Glukokortikoide (GCs) stellen wichtige Hormone in der Regulation der metabolischen Homöostase dar. Synthetische GCs, wie Dexamethasone (DEX), spielen eine essentielle Rolle in der Behandlung inflammatorischer Krankheiten. Jedoch sind unter einer Dexamethason-Therapie zahlreiche Nebenwirkungen bekannt, so z.B. auch die Entwicklung einer Hypertonie, in deren Pathogenese oxidativer Stress eine entscheidende Rolle spielt. Obwohl sich in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien zum Ziel setzten die GC-induzierte Hypertonie (GC-HT) aufzuklären, sind die genauen Mechanismen bis heute unklar. Eine erhöhte Expression von NADPH Oxidasen (Nox) und eine Entkopplung der endothelialen NO Synthase (eNOS), die Hauptquellen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im vaskulären System, tragen maßgeblich zur Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen bei. Daher ist eine Beteiligung dieser Enzyme in GC-induziertem oxidativen Stress sehr wahrscheinlich. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NADPH Oxidasen und eine entkoppelte eNOS die vielversprechendsten unter den zahlreichen involvierten pro- und anti-oxidativen Enzymen sind. Mit Fokus auf die oben genannten Systeme wurde in der vorliegenden Studie der Effekt von DEX mit Hilfe von in vivo (WKY Ratten) ebenso wie in vitro Experimenten (A7r5 und EA.hy 926 Zellen) untersucht. Dabei zeigte sich, dass Nox1, Nox4 und p22phox durch DEX unterschiedlich reguliert wurden. Nox1 wurde hoch-, Nox4 hingegen herunterreguliert, während p22phox unverändert blieb. Die Modufikation schien hierbei auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene stattzufinden. Durch die gegensätzliche Regulation von Nox1 und Nox4 bleibt die Nettowirkung der verschiedenen Nox Isoformen unklar. Immer mehr Studien bringen vaskulären oxidativen Stress mit der Pathogenese einer GC-HT in Zusammenhang, welche letztendlich zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) führt. Durch die eNOS produziertes NO stellt einen essentiellen Schutzfaktor der Blutgefäße dar. Eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit könnte die Folge einer eNOS-Entkopplung darstellen, ausgelöst durch oxidativen Stress. Da die Verfügbarkeit von Tetrahydrobiopterin (BH4) entscheident ist für die Aktivität und enzymatische Kopplung der eNOS, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit GC-induzierten Veränderungen in der BH4-Versorgung. Die Behandlung von EA.hy 926 Zellen mit DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von eNOS auf mRNA- und Proteinebene. Gleichzeitig wurde die Phosphorylierung an Serine1177 vermindert. Als maßgeblicher “Kopplungs-Schalter” kann BH4 endogen über zwei verschiedene Signalwege synthetisiert werden, welche durch die Enzyme GCH1 und DHFR reguliert werden. DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von BH4, BH2 und Biopterin, wobei ebenso das BH4 / BH2 -Verhältnis vermindert wurde. Beide Enzyme, GCH1 genauso wie DHFR, wurden auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert, was auf einen Effekt von GCs auf beide rnBH4-produzierenden Signalwege schließen lässt. Nach Behandlung mit DEX wurde die Produktion von NO in Endothelzellen maßgeblich vermindert. In ROS-Messungen zeigte sich eine Tendenz hin zu einer eNOS-Entkopplung, jedoch war es mit unserem experimentellen Aufbau nicht möglich, diese endgültig zu beweisen.rnZusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung mit GCs zu Veränderungen in beiden untersuchten Systemen, den NADPH Oxidasen ebenso wie dem eNOS-NO System, führte. DEX erhöhte die Expression von Nox1 in glatten Muskelzellen und reduzierte die Nox4-Expression in Endothelzellen. Gleichzeitig verminderte DEX die Verfügbarkeit von BH4 und inhibierte die Phosphorylierung / Aktivität von eNOS. Mithilfe weiterer Studien muss die endgültige Beteiligung von NADPH Oxidasen und einer eNOS-Entkopplung an oxidativem Stress in GC-HT abschließend aufgeklärt werden.rn