Untersuchungen zur Zell-Transistor-Kopplung mittels der Voltage-Clamp-Technik

Untersuchungen zur Zell-Transistor Kopplung mittels der Voltage-Clamp TechnikIn der vorliegenden Arbeit wird die extrazelluläre Einkopplung elektrischer Signale von Zellen in Transistoren hinsichtlich der an der Kopplung beteiligten Parameter untersucht. Dafür werden Zellen aus Primärkulturen und von Zell-Linien direkt auf den aktiven Sensorflächen der hergestellten Chips kultiviert. Für die Experimente werden n- und p-Kanal Feldeffekttransistoren (FET) sowie Extended-Gate-Elektroden (EGE) mit Gold- und Titanoberflächen entwickelt.Zur Untersuchung der Kopplungseigenschaften werden die neuronale Zell-Linie SH-SY5Y, die humane Endothel Zell-Linie EA.hy-926 sowie als Primärzellen hippocampale Neuronen und Kardiomyozyten embryonaler und neonataler Ratten eingesetzt. Die Voltage-Clamp Technik erlaubt die Untersuchung spannungsgesteuerter Ionenkanäle in der Zellmembran. Maßgebend für den Signalverlauf des extrazellulär eingekoppelten Signals ist der Ionenstrom von Na+, K+ und Ca2+ durch die Membran im Kontaktbereich zwischen Zelle und Sensor.Die Kopplung kann elektrisch mithilfe eines Ersatzschaltkreises beschrieben werden, der alle beteiligten elektrischen Größen der Membran und der Ionenströme, sowie die Parameter des Kontaktbereichs und des Sensors enthält.Die Simulation der extrazellulären Signale zeigt, dass die beobachteten Signalformen nur durch eine Erhöhung der Ionenkanaldichten und dadurch einer deutlich vergrößerten Leitfähigkeit der Ionenarten im Kontaktbereich gegenüber der freien Membran erklärt werden können.

Characterisation of the cell-transistor coupling

Die Verbindung von elektrisch aktiven, lebenden Zellen zu extrazellulären Sensorsystemen eröffnet vielfälige Möglichkeiten im Bereich der Biosensorik. Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zum tieferen Verständnis der elektrischen Kopplungsmechanismen zwischen den biologischen und elektronischen Teilen solcher Hybridsysteme. Es wurden dazu drei Hauptbereiche bearbeitet:Ein System zur extrazellulären Signalableitung an lebenden Zellen bestehend aus einem Sensorchip, einem Vorverstärkerkopf und einem Hauptverstärker wurde weiterentwickelt.Als Sensoren wurden entweder Metallmikroelektroden-Chips mit 64 Kanälen oder Feldeffekt Transistoren-Chips mit 16 Kanälen (FET) eingesetzt. Es wurden zusätzlich spezielle FET Sensoren mit Rückseitenkontakten hergestellt und eingesetzt.Die elektrische Kopplung von einzelnen Nervenzellen der neuronalen Zell-Linien SH-SY5Y und TR14 oder primär kultivierten Neuronen aus dem Hirnstamm oder dem Hippocampus von embryonalen Ratten mit den extrazellulären Sensoren wurde untersucht. In der 'whole-cell' Patch-Clamp Technik wurden die Beiträge der spannungsgesteuerten Na+- und K+-Ionenkanäle zur extrazellulären Signalform identifiziert. Die Simulation der Signale mit einem Ersatzschaltkreis (Punkt-Kontakt Modell), der in PSPICE implementiert wurde, deutet auf eine starke Abhängigkeit der Signalformen in bezug auf Konzentrationsänderungen von Na+- und K+-Ionen im Volumenbereich zwischen Zelle und den ionensensitiven Transistoren hin. Ein empirisch erweitertes Punkt-Kontakt Modell wurde daraufhin vorgestellt.Im dritten Teil der Arbeit wurden Zellschichten von Kardiomyocyten embryonaler Ratten auf den extrazellulären Sensoren kultiviert. Die Eignung eines solchen Hybridsensors als Modellherz fuer das pharmazeutische Screeing wurde durch Messungen mit Herzstimulanzien und -relaktanzien bestätigt.