Imiquimod based transcutaneous immunization – insights and novel concepts

This work aims at developing a transcutaneous immunization (TCI) approach in order to activate cytotoxic T-cells. A tumor specific immune response was therefore generated by the TLR7-Agonist imiquimod. Five commercially available creams including the innovators product Aldara® 5% creme were assessed to ascertain their capability to induce an immune response in C57BL/6 mice after dermal administration. Moreover, creams were investigated regarding their imiquimod permeation in a Franz-diffusion cell model. Results obtained from this study were used to develop novel formulation approaches based on dissolved state imiquimod in a submicron scale range. High pressure homogenization ensured emulsification as well as particle size reduction. A freeze dried spreadable solid nanoemulsion based on sucrose fatty acid esters and oil components represented a major formulation approach. Within the scope of this approach the influence of pharmaceutical oils i.e. middle chain triglycerides, avocado oil, jojoba wax, and squalen was assessed towards their TCI performance. Furthermore, an aqueous jojoba wax based emulsion gel was developed. Unlike the innovators product, all formulations demonstrated a distinctly reduced imiquimod permeation across murine skin, a fact particularly evident in case of jojoba wax. Squalen significantly augmented in vivo immune response (p≤0.05 Mann-Whitney-Test). The emulsion gel demonstrated a 10fold decrease of imiquimod permeation. In comparison with the innovators product, the emulsion gel induced an equal immune response with a simultaneously enhanced tumor rejection in a mouse model.

Die kutane murine Mastzelle als Initiator angeborener und adaptiver Immunreaktionen der Haut

Für lange Zeit wurde die Mastzelle nur als Effektorzelle im Rahmen von Erkrankungen des atopischen Formenkreises gesehen. Erst lange Zeit nach ihrer ersten Beschreibung konnte gezeigt werden, dass die Mastzelle einen wichtigen Beitrag zur Abwehr von Pathogenen leistet. Dies wird vor allem durch Wege der alternativen Mastzellaktivierung, z.B. über Toll- like Rezeptoren, ermöglicht. In dieser Arbeit sollte daher zunächst die mögliche Funktion der Mastzelle bei der durch den synthetischen TLR7- Liganden Imiquimod induzierten Entzündungsreaktion der Haut und der Auswanderung von Langerhans Zellen in einem Mausmodell untersucht werden. Beide Reaktion waren dabei von Mastzellen abhängig sind. Für die frühe und schnelle Induktion der Entzündungsreaktion zeigten sich vor allem die Mastzellcytokine IL-1 und TNF-α verantwortlich. Bei der Auswanderung der Langerhans Zellen hingegen spielt das Mastzell-IL1 eine entscheidende Rolle. Imiquimod wurde in Form der Creme Aldara bereits erfolgreich zur transkutanen Immunisierung (TCI) in Mausversuchen verwendet. Da die oben beschriebenen Reaktionen, welche durch Imiquimod vermittelt werden, eine deutliche Abhängigkeit von Mastzellen zeigten, sollte nun auch die Funktion der Mastzelle bei der Entstehung einer adaptiven Immunantwort am Modell der transkutanen Immunisierung untersucht werden. Der Immunisierungserfolg und damit die Entstehung einer adaptiven Immunantwort konnte auch hier auf die Anwesenheit von Mastzellen zurückgeführt werden. Mastzellen können somit als ein weiteres wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität gesehen werden und können so einen entscheidenden Einfluß auf die Entstehung einer adaptiven Immunantwort nehmen.

Der Einfluss der T-Zellavidität und der TLR-vermittelten Aktivierung Dendritischer Zellen der Haut auf die Funktion zytotoxischer T-Zellen

Zytotoxische T-Zellen (CTL) vermitteln die effektive und gezielte Lyse Virus-infizierter und maligner Zellen. Um den Einfluss der T-Zellavidität auf die Immunodominanz von CTL-Antworten zu untersuchen, wurde ein neues Mausmodell mit zwei T-Zellrezeptor (TCR)-transgenen Stämmen etabliert. Die T-Zellen der beiden Stämme exprimieren denselben TCR in unterschiedlicher Dichte. Studien mit diesem Modell zeigten, dass bei identischen Vorläuferfrequenzen die hochaviden T-Zellen nach Immunisierung auf Kosten der niederaviden T-Zellen proliferieren. Sind die niederaviden T-Zellen jedoch im Überschuss vorhanden, so können sie die Antwort dominieren. Hieraus lässt sich schließen, dass die CTL Immunodominanz durch die Avidität und die Vorläuferfrequenz der T-Zellklone bestimmt wird. Darüber hinaus wurde ein neues transkutanes Immunisierungsverfahren (TCI) entwickelt. Die Applikation eines CTL Epitops zusammen mit dem synthetischen Toll-like Rezeptor 7 Liganden Imiquimod führt zur effizienten Aktivierung TCR-transgener CTLs. Eine in Wild-typ Mäusen generierte CTL-Antwort gegen das SIINFEKL Epitop aus dem Ovalbumin vermittelt die effiziente Lyse inokulierter Ovalbumin-transgener Thymomzellen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass regulatorische T-Zellen die durch TCI vermittelte CTL Aktivierung inhibieren.

Der Transkriptionsfaktor NFATc2 ist essentiell für die Funktion von Mastzellen in vivo

Neueste Arbeiten zeigen, dass Mastzellen wichtige Funktionen innerhalb des angeborenen und erworbenen Immunsystems ausüben. Von zentraler Bedeutung ist hierbei die Fähigkeit der Mastzelle, auf IgE-unabhängige Signale zu reagieren und ein breites Spektrum an Cytokinen und Chemokinen zu produzieren. Transkriptionsfaktoren der NFAT-Familie sind wichtige Regulatoren der Immunhomöostase und Cytokinproduktion. In Mausmodellen führt die Defizienz des NFATc2 zu überschießenden Immunreaktionen, was ursächlich auf die Hyperreaktivität NFATc2-defizienter T-Zellen zurückgeführt wird. Demgegenüber zeigten unsere eigenen in vitro durchgeführten Arbeiten, dass die Produktion wichtiger entzündungsfördernder Cytokine in Mastzellen abhängig ist von NFATc2. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung von NFATc2 in einem Mastzell-abhängigen Modell der transkutanen Immunisierung mit einem TLR7-Liganden als Adjuvans zu untersuchen. Experimente an NFATc2-defizienten Mäusen ergaben zunächst, dass die Schlüsselprozesse Entzündung, Auswanderung antigenpräsen-tierender Zellen, Lymphknotenhypertrophie sowie Expansion und Funktion spezifischer T-Zellen in Abwesenheit des Transkriptionsfaktors NFATc2 extrem beeinträchtigt sind. Dieser experimentell induzierte Phänotyp gleicht somit dem mastzellloser Mäuse in dieser Immunisierungsstudie. Rekonstitutionsexperimente erlaubten es, in vitro generierte Mastzellen aus NFATc2-defizienten und NFATc2-kompetenten Spendern in mastzelllose Mäuse zu transferieren und deren Reaktivität in dem angewandten TLR7-abhängigen Entzündungsmodell in vivo zu vergleichen. Hierbei zeigte sich, dass die in NFATc2-defizienten Mäusen nach transkutaner Immunisierung zu beobachtenden Beeinträchtigungen gänzlich auf die Abwesenheit des NFATc2 in Mastzellen zurückzuführen sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen somit, dass der Transkriptionsfaktor NFATc2 für die Funktion der Mastzelle in vivo eine bedeutsame Rolle spielt. Dies betrifft sowohl Reaktionen des angeborenen als auch des erworbenen Immunsystems. Darüber hinaus könnte NFATc2 ein wichtiges Ziel bei therapeutischen Maßnahmen gegen mastzellabhängige Krankheiten darstellen.