Genetische Analyse des Somatostatin-Systems

Somatostatin ist ein Molekül mit multifunktinonellem Charakter, dem Neurotransmitter-, Neuromodulator- und (Neuro)-Hormoneigenschaften zugeschrieben werden. Gemäß seiner ubiquitären Verteilung in Geweben beeinflusst es Stoffwechsel- und Entwicklungsprozesse, bis hin zu Lern-und Gedächtnisleistungen. Diese Wirkungen resultieren aus dem lokalen und zeitlichen Zusammenspiel eines Liganden und fünf G-Protein gekoppelter Rezeptoren (SSTR1-5). Zur Charakterisierung der biologischen Bedeutung des Somatostatin-Systems im Gesamtorganismus wurde eine Mutationsanalyse einzelner Systemkomponenten durchgeführt. Sie umfaßte die Inaktivierung der Gene für das Somatostatin-Präpropeptid und die der Rezeptoren SSTR3 und SSTR4 durch Gene Targeting. Die entsprechenden Ausfallmutationen belegen: Weder die Rezeptoren 3 und 4, noch Somatostatin sind für das Überleben des Organismus unter Standardhaltungsbedingungen notwendig. Die entsprechenden Mauslinien zeigen keine unmittelbar auffälligen Einschränkungen ihrer Biologie. Die Somatostatin-Nullmaus wurde zum Hauptgegenstand einer detaillierten Untersuchung aufgrund der übergeordneten Position des Liganden in der Signalkaskade und verfügbaren Hinweisen zu seiner Funktion. Folgende Schlußfolgerungen konnten nach eingehender Analyse gezogen werden: Der Ausfall des Somatostatin-Gens hat erhöhte Plasmakonzentrationen an Wachstumshormon (GH) zur Konsequenz. Dies steht im Einklang mit der Rolle Somatostatins als hemmender Faktor der Wachstumshormon-Freisetzung, die in der Mutante aufgehoben ist. Durch die Somatostatin-Nullmaus wurde zudem deutlich: Somatostatin interagiert als wesentliches Bindeglied zwischen der Wachstums- und Streßachse. Permanent erhöhte Corticosteron-Werte in den Mutanten implizieren einen negativen tonischen Einfluß für die Sekretion von Glukocorticoiden in vivo. Damit zeigt die Knockout-Maus, daß Somatostatin normalerweise als ein entscheidendes inhibierendes Kontrollelement der Steroidfreisetzung fungiert. Verhaltensversuche offenbarten ein Defizit im motorischen Lernen. Somatostatin-Nullmäuse bleiben im Lernparadigma “Rotierender Stabtest” hinter ihren Artgenossen zurück ohne aber generell in Motorik oder Koordination eingeschränkt zu sein. Diese motorischen Lernvorgänge sind von einem funktionierenden Kleinhirn abhängig. Da Somatostatin und seine Rezeptoren kaum im adulten, wohl aber im sich entwickelnden Kleinhirn auftreten, belegt dieses Ergebnis die Funktion transient in der Entwicklung exprimierter Neuropeptide – eine lang bestehende, aber bislang experimentell nicht nachgewiesene Hypothese. Die Überprüfung weiterer physiologischer Parameter und Verhaltenskategorien unter Standard-Laborbedingunggen ergab keine sichtbaren Abweichungen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Damit steht nun ein Tiermodell zur weiterführenden Analyse für die Somatostatin-Forschung bereit: In endokrinologischen, elektrophysiologischen und verhaltens-biologischen Experimenten ist nun eine unmittelbare Korrelation selektiv mit dem Somatostatin-Peptid bzw. mit den Rezeptoren 3 und 4 aber auch in Kombination der Ausfallmutationen nach entsprechenden Kreuzungen möglich.

Elektrophysiologische Charakterisierung der Neurone im Tectum opticum des Goldfisches hinsichtlich Farbe und Bewegung

Die vorliegende Arbeit verfolgte mehrere Ziele. Die Hauptaufgabe war es, farbsensitive und bewegungssensitive Neurone im Tectum opticum des Goldfisches zu finden und diese hinsichtlich ihres Antwortverhaltens zu charakterisieren. Aus Verhaltensversuchen ist bekannt, dass sowohl das Ganzfeldbewegungssehen als auch das Objektbewegungssehen „farbenblind“ ist, da die Verarbeitung dieser Sehleistungen jeweils nur von einem Zapfentyp getrieben wird. Es sollte untersucht werden, ob sich diese Farbenblindheit auch auf Ebene der tectalen bewegungsempfindlichen Neurone finden lässt. Schließlich sollten die Ableitorte im Tectum opticum kartiert werden, um festzustellen, ob es jeweils bestimmte örtlich abgegrenzte Areale für Farbe einerseits und für Bewegung andererseits gibt.rnDie Aktivität von tectalen Units wurde durch extrazelluläre Ableitungen registriert. Um farbspezifische Neurone zu identifizieren und zu charakterisieren, wurden 21 verschiedene Farbpapiere (HKS-Standard) aus dem gesamten Farbenkreis (ausgenommen UV) präsentiert. Auf jedes Farbpapier folgte ein neutrales Graupapier. Des Weiteren wurde eine Schwarz-Weiß-Grau-Sequenz gezeigt, um das Antwortverhalten der Units auf Helligkeitswechsel zu prüfen. Jeder Stimulus wurde für fünf Sekunden präsentiert und die gesamte Stimulussequenz wurde mindestens dreimal wiederholt. Zur Identifizierung bewegungssensitiver Neurone wurde ein sich exzentrisch bewegendes schwarz-weißes Zufallspunktmuster präsentiert. Um die „Farbenblindheit“ des Bewegungssehens zu testen, wurden zwei rot-grüne Zufallspunktmuster präsentiert, die den L-Zapfen des Goldfisches unterschiedlich stark modulierten. Den meisten Units wurden sowohl die Farb- als auch die Bewegungsstimuli gezeigt.rnEs konnten 69 Units abgeleitet werden. Von diesen antworteten 34 sowohl auf Farbstimuli als auch auf Helligkeitsreize, 19 Units reagierten ausschließlich auf Farbstimuli, 15 Units zeigten sich nur für den Bewegungsstimulus sensitiv und zwei Units beantworteten ausschließlich Helligkeitswechsel. Die farbempfindlichen Units konnten in 14 Gruppen eingeteilt werden: sechs Gruppen im Rotbereich (22 Units), fünf Gruppen im Blau-Grünbereich (21 Units), eine Gruppe im Gelbbereich (zwei Units), eine Gruppe, die alle Farbstimuli mit Erhöhung der Aktivität (sechs Units) und eine Gruppe, die alle Farbstimuli mit Erniedrigung der Aktivität (eine Unit) beantwortete. Es wurden zwei Arten von Gegenfarbzellen gefunden: Rot-ON/Blau-und-Grün-OFF (12 Units) und Rot-OFF/Blau-und-Grün-ON (sieben Units). Es wurden verschiedene zeitliche Antwortmuster gefunden. Während einige Units nur Reizwechsel beantworteten, zeigten die meisten Units ein tonisches Antwortverhalten. Manche Units beantworteten jeden Stimuluswechsel phasisch und darüber hinaus bestimmte Stimuli tonisch. Die meisten tectalen Neurone zeigten eine Grundaktivität. Alle Units, denen sowohl der Farb- als auch der Bewegungsstimulus gezeigt wurden, antworteten nur auf eine Stimulusart. rnDiese Ergebnisse lassen folgende Schlüsse zu: Die Verarbeitung von Farbe und Bewegung im Tectum opticum des Goldfischs wird über zwei unterschiedlichen Verarbeitungswegen geleistet, da alle Units entweder auf Farb- oder auf Bewegungsstimuli antworten. Das Bewegungssehen wird im Goldfisch durch nur einen Zapfentyp (M- oder L-Zapfen) vermittelt und ist somit “farbenblind”, da alle bewegungssensitiven Units die Aktivität einstellten, wenn der Stimulus nur noch einen Zapfentyp modulierte. Es scheint spezifische Areale für „Farbe“ und „Bewegung“ im Tectum opticum des Goldfisches zu geben, da bewegungssensitive Units bevorzugt im posterio-medialen Bereich in einer Tiefe zwischen 200-400 µm gefunden und farbspezifische Units vor allem im anterio-medialen Bereich entdeckt wurden.

Membrane properties and synaptic integration of identified neuronal populations in the developing rodent neocortex

In my PhD work I concentrated on three elementary questions that are essential to understand the interactions between the different neuronal cell populations in the developing neocortex. The questions regarded the identity of Cajal-Retzius (CR) cells, the ubiquitous expression of glycine receptors in all major cell populations of the immature neocortex, and the role of taurine in the modulation of immature neocortical network activity.rnTo unravel whether CR cells of different ontogenetic origin have divergent functions I investigated the electrophysiological properties of YFP+ (derived from the septum and borders of the pallium) and YFP− CR cells (derived from other neocortical origins). This study demonstrated that the passive and active electrophysiological properties as well as features of GABAergic PSCs and glutamatergic currents are similar between both CR cell populations. These findings suggest that CR cells of different origins most probably support similar functions within the neuronal networks of the early postnatal cerebral cortex.rnTo elucidate whether glycine receptors are expressed in all major cell populations of the developing neocortex I analyzed the functional expression of glycine receptors on subplate (SP) cells. Activation of glycine receptors by glycine, -alanine and taurine elicited membrane responses that could be blocked by the selective glycinergic antagonist strychnine. Pharmacological experiments suggest that SP cells express functional heteromeric glycine receptors that do not contain 1 subunits. The activation of glycine receptors by glycine and taurine induced a membrane depolarization, which mediated excitatory effects. Considering the key role of SP cells in immature cortical networks and the development of thalamocortical connections, this glycinergic excitation may influence the properties of early cortical networks and the formation of cortical circuits.rnIn the third part of my project I demonstrated that tonic taurine application induced a massive increase in the frequency of PSCs. Based on their reversal potential and their pharmacological properties these taurine-induced PSCs are exclusively transmitted via GABAA receptors to the pyramidal neurons, while both GABAA and glycine receptors were implicated in the generation of the presynaptic activity. Accordingly, whole-cell and cell-attached recordings from genetically labeled interneurons revealed the expression of glycine and GABAA receptors, which mediated an excitatory action on these cells. These findings suggest that low taurine concentrations can tonically activate exclusively GABAergic networks. The activity level maintained by this GABAergic activity in the immature nervous system may contribute to network properties and can facilitate the activity dependent formation of adequate synaptic projections.rnIn summary, the results of my studies complemented the knowledge about neuronal interactions in the immature neocortex and improve our understanding of cellular processes that guide neuronal development and thus shape the brain.rn

Regulation der Funktion dendritischer Zellen im immunologischen steady state

Dendritische Zellen sind professionelle Antigenpräsentierende Zellen und übernehmen sowohl in der Aktivierung naiver T-Zellen als auch in der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz eine zentrale Funktion. Ruhende Dendritische Zellen im immunologischen Steady State induzieren antigenspezifisch Toleranz in autoreaktiven T-Zellen, welche bei der negativen Selektion im Thymus nicht eliminiert wurden und verhindern somit die Entstehung von Autoimmunität. Mit Hilfe eines transgenen Maus Modells, welches die induzierbare Expression transgen kodierter CD8+ T-Zell-Epitope auf ruhenden Dendritischen Zellen erlaubt, konnten wir zeigen, dass die periphere Toleranz Induktion durch Dendritische Zellen in Abwesenheit von regulatorischen T-Zellen beeinträchtigt ist. Wir konnten verdeutlichen, dass für die Suppression von steady-state Dendritischen Zellen die Erkennung von MHC Klasse II Molekülen auf Dendritischen Zellen durch den T-Zell-Rezeptor regulatorischer T-Zellen zwingend erforderlich ist. In Abwesenheit dieser suppressiven Interaktion hatten Dendritische Zellen einen aktivierten Phänotyp und lösten eine funktionale T-Zell-Antwort aus, anstatt periphere Toleranz zu induzieren. Als Folge dessen entwickelten Mäuse, in denen Dendritische Zellen nicht antigenspezifisch mit suppressiven CD4+ T-Zellen interagieren konnten, spontane Autoimmunität, welche durch CD8+ T-Zellen mediiert wurde. Wir konnten weiterhin zeigen, dass der Verlust peripherer T-Zell Toleranz durch basale Level an Typ I Interferonen mediiert wird sowie durch CD40 Signale, welche von adaptiven Immunzellen geliefert werden.

In vitro modulation of epileptiform activity in the hippocampal formation of immature rodents by GABAergic antagonists, dopamine and methylxanthines

Während des frühen Lebens stellen epileptische Anfälle schwere neurologische Zustände dar, weil sie ein großer Risikofaktor für die Manifestation der Epilepsie sind und eine hohe pharmakologische Resistenz zeigen. In meiner Doktorarbeit konzentrierte ich mich auf die Frage, wie verschiedene Neurotransmitter-Systeme und klinisch verwendete Medikamente epileptiforme Entladungen im perinatalen Hippocampus beeinflussen. rnIm ersten Teil meines Projektes untersuchte ich die Wirkung von GABA-Antagonisten und Modulatoren, die zwischen phasischen und tonischen GABAergen Strömen differenzieren, auf Feldpotentialaktivität in Hippocampusschnitten. Diese Experimente zeigten, dass im unreifen Hippocampus synaptische GABAerge Aktivität benötigt wird, um die Erregbarkeit zu begrenzen, während tonische GABAerge Ströme die Erregbarkeit verstärken können. Dies könnte darauf hinweisen, dass Antiepileptika mit einer höheren Spezifität für synaptische GABAA-Rezeptoren wirksamer zur Behandlung von epileptischen Anfällen bei Neugeborenen sein können. rnUm den Einfluss von Dopamin auf die Erregbarkeit des unreifen Hippocampus herauszufinden, untersuchte ich im zweiten Teil meiner Arbeit die Wirkung von verschiedenen Dopaminkonzentrationen und spezifische Agonisten und Antagonisten der Dopamin-Rezeptor-Subtypen auf epileptiforme Entladungen. Diese Experimente zeigten, dass niedrige Dopamin Konzentrationen eine antikonvulsive Wirkung haben, welche vom D2-ähnliche-Rezeptor-Agonisten Quinpirol nachgeahmt werden kann, während höhere Dopamin-Konzentrationen eine prokonvulsive Wirkung über Aktivierung von D1-ähnlichen Rezeptoren hervorrufen. Obwohl unsere Untersuchungen eine mögliche Verwendung von D2-ähnlichen Rezeptor-Agonisten zur Kontrolle epileptischer Anfälle in Neugeborenen nahelegen, müssen mögliche negative Auswirkungen von DAergen Agonisten und Antagonisten auf die neuronale Entwicklung berücksichtigt werden.rnIm dritten Teil meiner Arbeit untersuchte ich welche Konzentrationen von Methylxanthinen epileptische Anfälle in Hippocampuspreparationen auslösen die synaptische Übertragungen verändern können. Diese Experimente zeigten, dass sowohl Theophyllin als auch Koffein in höheren Konzentrationen die basale synaptische Übertragungen in der CA1-Region des Hippocampus modifizieren und epileptiforme Entladungen provozieren. Die Auswirkungen auf die postsynaptischen Antworten und spontanen epileptiformen Entladungen durch Koffein waren weniger ausgeprägt, was darauf hindeutet, dass diese Substanz potentiell vorteilhafter für therapeutische Anwendungen bei Frühgeborenen sein kann. rnZusammenfassend bereichern die Ergebnisse meiner Studie erheblich unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen epileptiformer Aktivität im unreifen Hippocampus und den therapeutischen Einsatz von Methylxanthinen und Pharmaka, die auf das GABAerge und DArge System einwirken.rnrn

Assemblierung und Stöchiometrie von GABA-A-Rezeptoren : Bedeutung einzelner Untereinheiten in einem pentameren Komplex

Im Rahmen des Promotionsprojektes wurden a1,4,6-enthaltende GABAA-Rezeptoren in den Kombinationen ab3X (X= b3, g2, d) mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik charakterisiert. Dazu wurde ein Set an Plasmiden erstellt, welche es erlauben GABAA-Rezeptoren definierter Stöchiometrie und Nachbarschaftsbeziehungen der Untereinheiten (UE) zu exprimieren. In der sogenannten Standardkonfiguration g2baba wurden folgende Resultate erhalten; (1) Assemblierungen, bei denen beide N-Termini der a-UE nicht verlinkt sind, zeigten, dass beide GABA-Bindestellen gleichwertig sind. (2) Die Benzodiazepinpharmakologie wird im Wesentlichen durch die a-UE neben der g2-UE determiniert. (3) Weiterhin wurde gezeigt, dass für eine vollständige Inhibition GABA-induzierter Ströme durch Furosemid eine a4- oder a6-UE unabhängig der Position im Pentamer ausreichend ist. (4) Charakterisierungen mit Etomidat und Loreclezol haben für a4b3g2 Rezeptoren ergeben, dass zwei b3-Untereinheiten im Pentamer vorliegen. (5) Für die b2-selektive Substanz E033-00233 konnte gezeigt werden, dass deren Wirkung unabhängig der Position der b2-UE, aber in Abhängigkeit ihrer Anzahl im Pentamer additiv ist. Insgesamt liefert die Konkatamerstragie eine Möglichkeit die Rolle von einzelnen Untereinheiten in pentameren GABAA-Rezeptoren zu studieren. Um Fehlinterpretationen weitestgehend zu vermeiden sind aber sorgfältige Kontrollen mit unterschiedlichen Linkerpositionen und der Einsatz von UE-selektiven notwendig.