Investigations on DNA methylation by Dnmt2 and impact of tRNA modifications on TLR7 stimulation

The incorporation of modified nucleotides into ribonucleic acids (RNAs) is important for their structure and proper function. These modifications are inserted by distinct catalytic macromolecules one of them being Dnmt2. It methylates the Cytidine (C) at position 38 in tRNA to 5-methylcytidine (m5C). Dnmt2 has been a paradigm in this respect, because all of its nearest neighbors in evolution are DNA-cytosine C5-methyltransferases and methylate DNA, while its (own) DNA methyltransferase activity is the subject of controversial reports with rates varying between zero and very weak. This work determines whether the biochemical potential for DNA methylation is present in the enzyme. It was discovered that DNA fragments, when presented as covalent RNA:DNA hybrids in the structural context of a tRNA, can be more efficiently methylated than the corresponding natural tRNA substrate. Additional minor deviations from a native tRNA structure that were seen to be tolerated by Dnmt2 were used for a stepwise development of a composite system of guide RNAs that enable the enzyme to perform cytidine methylation on single stranded DNA in vitro. Furthermore, a proof-of-principle is presented for utilizing the S-adenosyl methionine-analog cofactor SeAdoYn with Dnmt2 to search for new possible substrates in a SELEX-like approach.rnIn innate immunity, nucleic acids can function as pathogen associated molecular patterns (PAMPs) recognized by pattern recognition receptors (PRRs). The modification pattern of RNA is the discriminating factor for toll-like receptor 7 (TLR7) to distinguish between self and non-self RNA of invading pathogens. It was found that a 2'-O-methylated guanosine (Gm) at position18, naturally occurring at this position in some tRNAs, antagonizes recognition by TLR7. In the second part of this work it is pointed out, that recognition extends to the next downstream nucleotide and the effectively recognized molecular detail is actually a methylated dinucleotide. The immune silencing effect of the ribose methylation is most pronounced if the dinucleotide motif is composed of purin nucleobases whereas pyrimidines diminish the effect. Similar results were obtained when the Gm modification was transposed into other tRNA domains. Point mutations abolishing base pairings important for a proper tertiary structure had no effect on the immune stimulatory potential of a Gm modified tRNA. Taken together these results suggest a processive type of RNA inspection by TLR7.rn

Die kutane murine Mastzelle als Initiator angeborener und adaptiver Immunreaktionen der Haut

Für lange Zeit wurde die Mastzelle nur als Effektorzelle im Rahmen von Erkrankungen des atopischen Formenkreises gesehen. Erst lange Zeit nach ihrer ersten Beschreibung konnte gezeigt werden, dass die Mastzelle einen wichtigen Beitrag zur Abwehr von Pathogenen leistet. Dies wird vor allem durch Wege der alternativen Mastzellaktivierung, z.B. über Toll- like Rezeptoren, ermöglicht. In dieser Arbeit sollte daher zunächst die mögliche Funktion der Mastzelle bei der durch den synthetischen TLR7- Liganden Imiquimod induzierten Entzündungsreaktion der Haut und der Auswanderung von Langerhans Zellen in einem Mausmodell untersucht werden. Beide Reaktion waren dabei von Mastzellen abhängig sind. Für die frühe und schnelle Induktion der Entzündungsreaktion zeigten sich vor allem die Mastzellcytokine IL-1 und TNF-α verantwortlich. Bei der Auswanderung der Langerhans Zellen hingegen spielt das Mastzell-IL1 eine entscheidende Rolle. Imiquimod wurde in Form der Creme Aldara bereits erfolgreich zur transkutanen Immunisierung (TCI) in Mausversuchen verwendet. Da die oben beschriebenen Reaktionen, welche durch Imiquimod vermittelt werden, eine deutliche Abhängigkeit von Mastzellen zeigten, sollte nun auch die Funktion der Mastzelle bei der Entstehung einer adaptiven Immunantwort am Modell der transkutanen Immunisierung untersucht werden. Der Immunisierungserfolg und damit die Entstehung einer adaptiven Immunantwort konnte auch hier auf die Anwesenheit von Mastzellen zurückgeführt werden. Mastzellen können somit als ein weiteres wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität gesehen werden und können so einen entscheidenden Einfluß auf die Entstehung einer adaptiven Immunantwort nehmen.

Der Transkriptionsfaktor NFATc2 ist essentiell für die Funktion von Mastzellen in vivo

Neueste Arbeiten zeigen, dass Mastzellen wichtige Funktionen innerhalb des angeborenen und erworbenen Immunsystems ausüben. Von zentraler Bedeutung ist hierbei die Fähigkeit der Mastzelle, auf IgE-unabhängige Signale zu reagieren und ein breites Spektrum an Cytokinen und Chemokinen zu produzieren. Transkriptionsfaktoren der NFAT-Familie sind wichtige Regulatoren der Immunhomöostase und Cytokinproduktion. In Mausmodellen führt die Defizienz des NFATc2 zu überschießenden Immunreaktionen, was ursächlich auf die Hyperreaktivität NFATc2-defizienter T-Zellen zurückgeführt wird. Demgegenüber zeigten unsere eigenen in vitro durchgeführten Arbeiten, dass die Produktion wichtiger entzündungsfördernder Cytokine in Mastzellen abhängig ist von NFATc2. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung von NFATc2 in einem Mastzell-abhängigen Modell der transkutanen Immunisierung mit einem TLR7-Liganden als Adjuvans zu untersuchen. Experimente an NFATc2-defizienten Mäusen ergaben zunächst, dass die Schlüsselprozesse Entzündung, Auswanderung antigenpräsen-tierender Zellen, Lymphknotenhypertrophie sowie Expansion und Funktion spezifischer T-Zellen in Abwesenheit des Transkriptionsfaktors NFATc2 extrem beeinträchtigt sind. Dieser experimentell induzierte Phänotyp gleicht somit dem mastzellloser Mäuse in dieser Immunisierungsstudie. Rekonstitutionsexperimente erlaubten es, in vitro generierte Mastzellen aus NFATc2-defizienten und NFATc2-kompetenten Spendern in mastzelllose Mäuse zu transferieren und deren Reaktivität in dem angewandten TLR7-abhängigen Entzündungsmodell in vivo zu vergleichen. Hierbei zeigte sich, dass die in NFATc2-defizienten Mäusen nach transkutaner Immunisierung zu beobachtenden Beeinträchtigungen gänzlich auf die Abwesenheit des NFATc2 in Mastzellen zurückzuführen sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen somit, dass der Transkriptionsfaktor NFATc2 für die Funktion der Mastzelle in vivo eine bedeutsame Rolle spielt. Dies betrifft sowohl Reaktionen des angeborenen als auch des erworbenen Immunsystems. Darüber hinaus könnte NFATc2 ein wichtiges Ziel bei therapeutischen Maßnahmen gegen mastzellabhängige Krankheiten darstellen.

Signaltransduktion von IgG-Antiphospholipid-Antikörpern in plasmazytoiden Dendriten und Monomac1 Zellen

Das Antiphospholipid-Syndrom (APS) ist eine Autoimmunerkrankung die sich durch venöse und arterielle Thrombosen und/oder Spontanaborte bei gleichzeitigem Nachweis von persistierenden, erhöhten Antiphospholipid-Antikörper (aPL)-Titern charakterisieren lässt. Die zugrunde liegenden Mechanismen, über die aPL Pathogenität vermitteln, sind bislang wenig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass drei humane monoklonale IgG aPL sowie IgG Fraktionen von APS Patienten eine Überexpression von TLR7 und TLR8 in plasmazytoiden dendritischen Zellen bzw. monozytären Zellen induzieren. Gleichzeitig erfolgt die Induktion der TLR7/8 Translokation vom endoplasmatischen Retikulum (ER) ins Endosom. Diese Effekte werden durch die Internalisierung der aPL und die nachfolgende Aktivierung einer NADPH Oxidase sowie durch endosomale Superoxid Produktion vermittelt. Als Folge dessen werden die Zellen extrem für TLR7/8 Liganden sensibilisiert. Diese Beobachtungen beschreiben einen neuen Signalmechanismus der innaten Immunität, der seinen Ursprung im Endosom nimmt. Da die Überexpression von TLR7 auch in pDCs von APS Patienten detektiert werden konnte, bieten unsere Ergebnisse eine Erklärung für die proinflammatorischen und prokoagulanten Effekte von aPL. rnWeiterhin führte die kombinierte Stimulation mit aPL und TLR7 Liganden in pDCs zu einem signifikant verstärkten Potential zur CD4+ Th2 Zell Aktivierung bzw. zur Regulation der B-Zell Differenzierung und Immunglobulin Produktion. Die Anwesenheit der pDCs erhöhte dabei synergistisch die CD40/86 Expression, die Proliferation sowie die Plasmazell-Differenzierung von isolierten peripheren B-Zellen, die mit aPL und TLR Liganden stimuliert wurden. Dieser Stimulationsansatz war außerdem ausreichend um naive B-Zellen zur IgM/IgG Produktion anzuregen und die Synthese neuer IgG aPL durch Gedächtnis-B-Zellen einzuleiten. Die Beteiligung der pDCs an diesem Prozess erfolgte durch Zytokin Sekretion sowie direktem Zell-Zell-Kontakt. Die Anwesenheit von Th2-Helferzellen war dabei nicht obligatorisch, konnte jedoch die B-Zell Aktivierung zusätzlich fördern. Eine Hochregulierung von TLR7 oder TLR9 innerhalb der B-Zell Population war nicht involviert. rnrnDiese Ergebnisse zeigen erstmalig die Relevanz einer pDC Aktivierung im Hinblick auf die Aufrechterhaltung der pathogenen Aktivität im Rahmen des APS. Da eine Dysregulierung von TLR7 bereits als ursächlich für die Ausbildung einer systemischen Autoimmunität erachtet wird, sollten unsere Ergebnisse für das generelle Verständnis von Autoimmunität von großer Relevanz sein.rn

Imiquimod based transcutaneous immunization – insights and novel concepts

This work aims at developing a transcutaneous immunization (TCI) approach in order to activate cytotoxic T-cells. A tumor specific immune response was therefore generated by the TLR7-Agonist imiquimod. Five commercially available creams including the innovators product Aldara® 5% creme were assessed to ascertain their capability to induce an immune response in C57BL/6 mice after dermal administration. Moreover, creams were investigated regarding their imiquimod permeation in a Franz-diffusion cell model. Results obtained from this study were used to develop novel formulation approaches based on dissolved state imiquimod in a submicron scale range. High pressure homogenization ensured emulsification as well as particle size reduction. A freeze dried spreadable solid nanoemulsion based on sucrose fatty acid esters and oil components represented a major formulation approach. Within the scope of this approach the influence of pharmaceutical oils i.e. middle chain triglycerides, avocado oil, jojoba wax, and squalen was assessed towards their TCI performance. Furthermore, an aqueous jojoba wax based emulsion gel was developed. Unlike the innovators product, all formulations demonstrated a distinctly reduced imiquimod permeation across murine skin, a fact particularly evident in case of jojoba wax. Squalen significantly augmented in vivo immune response (p≤0.05 Mann-Whitney-Test). The emulsion gel demonstrated a 10fold decrease of imiquimod permeation. In comparison with the innovators product, the emulsion gel induced an equal immune response with a simultaneously enhanced tumor rejection in a mouse model.