Studying MHC I-dependent CD8 + T cell responses in the model of murine cutaneous leishmaniasis

Der Ausheilung von Infektionen mit Leishmania major liegt die Sekretion von IFN- von sowohl CD4+ als auch CD8+ T Zellen zugrunde.rnAktuell konnte in der Literatur nur ein Epitop aus dem parasitären LACK Protein für eine effektive CD4+ T Zell-vermittelte Immunantwort beschrieben werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, mögliche MHC I abhängige CD8+ T Zell Antworten zu untersuchen. rnFür diesen Ansatz wurde als erstes der Effekt einer Vakzinierung mit LACK Protein fusioniert an die Protein-Transduktionsdomäne des HIV-1 (TAT) analysiert. Die Effektivität von TAT-LACK gegenüber CD8+ T Zellen wurde mittels in vivo Protein-Vakzinierung von resistenten C57BL/6 Mäusen in Depletions-Experimenten gezeigt.rnDie Prozessierung von Proteinen vor der Präsentation immunogener Peptide gegenüber T Zellen ist unbedingt erforderlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Rolle des IFN--induzierbaren Immunoproteasoms bei der Prozessierung von parasitären Proteinen und Präsentation von Peptiden gebunden an MHC I Moleküle durch in vivo und in vitro Experimente untersucht. Es konnte in dieser Arbeit eine Immunoproteasom-unabhängige Prozessierung aufgezeigt werden.rnWeiterhin wurde Parasitenlysat (SLA) von sowohl Promastigoten als auch Amastigoten fraktioniert. In weiterführenden Experimenten können diese Fraktionen auf immunodominante Proteine/Peptide hin untersucht werden. rnLetztlich wurden Epitop-Vorhersagen für CD8+ T Zellen mittels computergestützer Software von beiden parasitären Lebensformen durchgeführt. 300 dieser Epitope wurden synthetisiert und werden in weiterführenden Experimenten zur Charakterisierung immunogener Eigenschaften weiter verwendet. rnIn ihrer Gesamtheit trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verständnis über die komplexen Mechanismen der Prozessierung und letztendlich zur Identifikation von möglichen CD8+ T Zell Epitopen bei. Ein detailiertes Verständnis der Prozessierung von CD8+ T Zell Epitopen von Leishmania major über den MHC Klasse I Weg ist von höchster Bedeutung. Die Charakterisierung sowie die Identifikation dieser Peptide wird einen maßgeblichen Einfluss auf die weiteren Entwicklungen von Vakzinen gegen diesen bedeutenden human-pathogenen Parasiten mit sich bringen. rn

Synthese tumorassoziierter Glycopeptidkonjugate basierend auf den epithelialen Mucinen MUC1 und MUC4 als potentielle Antitumorvakzine

Die Immuntherapie stellt eine hoffnungsvolle Alternative zu etablierten Behandlungsmethoden für Krebserkrankungen dar. Durch die Aktivierung des Immunsystems erhofft man sich eine selektive Abtötung von Tumorzellen. Eine solche Aktivierung kann durch Vakzinierung mit Glycopeptiden, welche Partialstrukturen tumorassoziierter Oberflächenglycoproteine darstellen, erfolgen. Um eine effektive Immunantwort zu erreichen, ist allerdings eine Konjugation dieser Glycopeptide mit immunogenen Trägern nötig. Zur Darstellung solcher Konjugate wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst mehrere, mit tumorassoziierten Kohlenhydraten glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt. Diese Bausteine wurden anschließend zur Festphasensynthese von Glycopeptiden eingesetzt. Durch ein neuartiges, chemoselektives Kupplungsverfahren konnten diese tumorassoziierten Glycopeptide an ein immunogenes Trägerprotein angebunden werden. Weiterhin wurde durch Festphasenpeptidsynthese ausgehend von einem tetrafunktionellen Lysin-Baustein ein dendrimeres Glycopeptid (MAP) erzeugt. Die Darstellung von vollsynthetischen Vakzinen gelang in Form von Konjugaten bestehend aus einem universellen T-Zell-Epitop und einem tumorassoziierten Glycopeptid. Diese Synthesen wurden ausgehend von einem festphasengebundenen, orthogonal geschützten Lysin durchgeführt. Abschließend wurde die Synthese von Konjugaten bestehend aus einem tumorassoziierten Glycopeptid und dem Mitogen Pam3Cys untersucht.

Synthese von tumor-assoziierten MUC1-Mucin-Glycopeptid-Vakzinen und deren immunologische Evaluierung

Eine alternative Methode zur Therapie von Tumorerkrankungen bestünde in einer Immuntherapie ausgelöst durch synthetische Antitumor-Vakzine. Ein vielversprechendes Zielmolekül für eine solche Aktivimmunisierung ist das Glycoprotein MUC1, das auf nahezu allen Epithelgeweben exprimiert und auf Tumorgeweben stark überexprimiert wird. Seine extrazelluläre Domäne enthält eine Vielzahl von Tandem-Repeat-Sequenzen der Art: HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA mit fünf potentiellen O-Glycosylierungs-Positionen. Da die Form der Glycosylierung des MUC1 in Tumorzellen stark von der auf normalen Zellen abweicht, liegen auf Tumorzellen eine Reihe tumor-assoziierter Saccharidantigene und Peptidepitope vor.rnIn dieser Arbeit wurden tumor-assoziierte Glycopeptidantigene aus der MUC1-Tandem-Repeat-Region hergestellt. Die synthetisierten MUC1-Glycopeptide tragen in verschiedenen Positionen eine Glycosylierung mit den tumor-assoziierten Tn- und STn-Saccharid-Antigenen. Zur Gewinnung von Vakzinen wurden diese Glycopeptid-Antigene über einen Spacer mit immunstimulierenden Komponenten verknüpft. Als Immunstimulanzien wurden ein T-Zell-Epitop aus dem Ovalbumin (OVA323-339) sowie die Carrier-Proteine Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanus-Toxoid (TTox) verwendet. rnDie synthetischen MUC1-Glycopeptide wurden durch Immunisierung von Mäusen einer immunologischen Evaluierung unterzogen. Insbesondere die synthetischen MUC1-Glycopeptid-TTox-Vakzine lösen sehr starke Immunantworten aus. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierten Antikörper stark an Tumorzellen und auch an Mammakarzinom-Gewebe binden, was für die Entwicklung von Antitumor-Vakzinen als vielversprechend einzustufen ist.

Untersuchung der Bindung des humanen Papillomvirus HPV16 an Heparansulfate der Zelloberfläche

In 99,7% aller Zervixkarzinome kann die DNA humaner Papillomviren (HPV) nachgewiesen werden, die somit den Hauptauslöser für eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen weltweit darstellen. HPV16 ist verantwortlich für etwa 50% aller Zervixkarzinome. Für die Infektion von Zellen mit HPV16 ist die Interaktion mit Heparansulfatproteoglykanen der Zelloberfläche essentiell. Um Aminosäuren auf der Oberfläche des majoren Kapsidproteins L1 von HPV16 zu identifizieren, die zu dieser Interaktion beitragen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zahlreiche Punktmutanten hergestellt und analysiert. Der Austausch der drei Lysine K278, K356 und K361 zu Alaninen führte zu signifikant verminderter Zell-, Heparin- und Heparansulfatbindung, die noch weiter reduziert wurde, wenn zwei oder drei der Lysine gleichzeitig mutiert waren. Auch die Infektiosität der mutanten Pseudovirionen war stark beeinträchtigt, die Trippelmutante zeigte nur noch 5% Infektiosität. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die drei Lysine gemeinsam die Bindestelle für Heparansulfate bilden. Ihr Austausch zu Argininen beeinflusste die Infektiosität der Partikel hingegen nicht, was bestätigt, dass die Interaktion mit Heparansulfaten von der positiven Ladungsdichte abhängt und nicht sequenzspezifisch ist. Die drei Lysine befinden sich auf der Spitze des HPV16-Kapsomers in einer flachen Tasche, die aufgrund ihrer Struktur bereits früher als potentielle Rezeptorbindestelle vorgeschlagen wurde. Fab-Fragmente des bindungsneutralisierenden Antikörpers H16.56E, dessen Epitop in direkter Nachbarschaft der Lysine liegt, inhibierten die heparansulfatvermittelte Zellbindung viraler Partikel. Auch Epitope anderer bindungsneutralisierender Antikörper befinden sich in der Nähe. Dies untermauert die Hypothese, dass die Lysine K278, K356 und K361 die Heparansulfatbindestelle von HPV16 bilden. Der Austausch von Threoninen, die genau zwischen den Lysinen liegen, hatte keine Auswirkung auf Bindung der Partikel und Infektiosität. Sie könnten jedoch durch die Bildung von Wasserstoffbrücken die Bindung an Heparansulfat stabilisieren. Die Bedeutung der Lysine K278, K356 und K361 bei der primären Interaktion von HPV16 mit Heparansulfaten konnte durch die Computersimulation der Interaktion der Virusoberfläche mit einem Heparinmolekül bestätigt werden. Des Weiteren konnten Anforderungen ermittelt werden, die eine solche Interaktion an das Heparinmolekül stellt. Weiterhin zeigten die Ergebnisse dieser Arbeit, dass basische Aminosäuren in der interkapsomeren Grube nicht an der primären Zellbindung an Heparansulfate beteiligt zu sein scheinen, aber eine Rolle bei sekundären Interaktionen mit der Zelloberfläche spielen könnten.

Analysis of the influence of epitope flanking regions on MHC class I restricted antigen presentation

Peptides presented by MHC class I molecules for CTL recognition are derived mainly from cytosolic proteins. For antigen presentation on the cell surface, epitopes require correct processing by cytosolic and ER proteases, efficient TAP transport and MHC class I binding affinity. The efficiency of epitope generation depends not only on the epitope itself, but also on its flanking regions. In this project, the influence of the C-terminal region of the model epitope SIINFEKL (S8L) from chicken ovalbumin (aa 257-264) on antigen processing has been investigated. S8L is a well characterized epitope presented on the murine MHC class I molecule, H-2Kb. The Flp-In 293Kb cell line was transfected with different constructs each enabling the expression of the S8L sequence with different defined C-terminal flanking regions. The constructs differed at the two first C-terminal positions after the S8L epitope, so called P1’ and P2’. At these sites, all 20 amino acids were exchanged consecutively and tested for their influence on H-2Kb/S8L presentation on the cell surface of the Flp-In 293Kb cells. The detection of this complex was performed by immunostaining and flow cytometry. The prevailing assumption is that proteasomal cleavages are exclusively responsible for the generation of the final C-termini of CTL epitopes. Nevertheless, recent publications showed that TPPII (tripeptidyl peptidase II) is required for the generation of the correct C-terminus of the HLA-A3-restricted HIV epitope Nef(73-82). With this background, the dependence of the S8L generation on proteasomal cleavage of the designed constructs was characterized using proteasomal inhibitors. The results obtained indicate that it is crucial for proteasomal cleavage, which amino acid is flanking the C-terminus of an epitope. Furthermore, partially proteasome independent S8L generation from specific S8L-precursor peptides was observed. Hence, the possibility of other existing endo- or carboxy-peptidases in the cytosol that could be involved in the correct trimming of the C-terminus of antigenic peptides for MHC class I presentation was investigated, performing specific knockdowns and using inhibitors against the target peptidases. In parallel, a purification strategy to identify the novel peptidase was established. The purified peaks showing an endopeptidase activity were further analyzed by mass spectrometry and some potential peptidases (like e.g. Lon) were identified, which have to be further characterized.

Isolierung und Charakterisierung der ER-residenten Aminopeptidase ERMP1 und Untersuchung ihrer Funktion in der Prozessierung MHC I restringierter CTL Epitope

Die effiziente Generierung von Peptid-Epitopen aus zelleigenen oder viralen Proteinen für die Präsentation auf „Major Histocompatibility Complex I“ (MHC I) Molekülen ist essentiell für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems und die Effektorfunktion der CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTLs). CTLs erkennen diese Peptide in Kontext mit MHC I Molekülen über ihren spezifischen T-Zellrezeptor (TCR). Die Generierung dieser Epitope ist das Resultat eines komplexen proteolytischen Prozesses, der im Zytosol und im endoplasmatischen Retikulum (ER) stattfindet. Im Zytosol generiert das Proteasom N-terminal verlängerte Epitop-Vorläufer. Diese werden durch weitere zytosolische Proteasen abgebaut, es sei denn, sie werden durch den „transporter associated with antigen processing“ (TAP) in das ER transportiert. Dort werden sie durch Aminopeptidasen getrimmt, um den Bindungsvoraussetzungen der MHC I Moleküle zu genügen. Im murinen System ist die „ER aminopeptidase associated with antigen processing“ (ERAAP) die bislang einzige beschriebene Aminopeptidase, die dieses N-terminale Trimming von CTL Epitopen vermitteln kann. Das Profil der proteolytischen Aktivität in angereichertem murinen ER kann jedoch nicht allein durch die Aktivität von ERAAP erklärt werden, was auf die Anwesenheit weiterer Aminopeptidasen mit einer potentiellen Funktion in der Antigenprozessierung hinweist. In dieser Arbeit konnte die immunologisch bislang noch nicht beschriebene Aminopeptidase ERMP1 (endoplasmic reticulum metallopeptidase 1) im murinen ER identifiziert werden. Nach Aufreinigung muriner Mikrosomen und anschließender Anionenaustausch-Chromatographie wurden die gesammelten Fraktionen mit fluorogenen Substraten auf Aminopeptidase-Aktivität getestet. Durch massenspektrometrische Analyse konnten in den beobachteten Peaks die schon beschriebenen Aminopeptidasen ERAAP, die „insulin regulated aminopeptidase“ IRAP und die immunologisch bislang nicht beschriebene Aminopeptidase ERMP1 identifiziert werden. Durch Fluoreszenzmikroskopie konnte die intrazelluläre Lokalisation von ERMP1 im ER durch Kolokalisation mit TAP verifiziert werden. Wie viele Komponenten des MHC I Prozessierungsweges wird auch die Expression von ERMP1 durch IFN-γ stimuliert. Dies macht ERMP1 zu einer potentiellen zweiten trimmenden Aminopeptidase im murinen ER. Überexpression von ERMP1 hat einen allelspezifischen Einfluss auf die globale MHC I Präsentation auf der Zelloberfläche und durch Überexpression und shRNA vermitteltes gene silencing konnte außerdem ein epitopspezifischer Effekt nachgewiesen werden. Da N-terminales Trimming durch ERAAP mit der Evasion von Tumoren und veränderter Immundominanz assoziiert wird, ist die detaillierte Charakterisierung der Aminopeptidase ERMP1 ein wichtiger Schritt zum Verständnis der MHC I Antigen-Prozessierung und der Generierung von CTL Epitopen im ER.

Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn