New biosensor applications of surface plasmon and hydrogel optical waveguide spectroscopy

Rapid and sensitive detection of chemical and biological analytes becomes increasingly important in areas such as medical diagnostics, food control and environmental monitoring. Optical biosensors based on surface plasmon resonance (SPR) and optical waveguide spectroscopy have been extensively pushed forward in these fields. In this study, we combine SPR, surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) and optical waveguide spectroscopy with hydrogel thin film for highly sensitive detection of molecular analytes.rnrnA novel biosensor based on SPFS which was advanced through the excitation of long range surface plasmons (LRSPs) is reported in this study. LRSPs are special surface plasmon waves propagating along thin metal films with orders of magnitude higher electromagnetic field intensity and lower damping than conventional SPs. Therefore, their excitation on the sensor surface provides further increased fluorescence signal. An inhibition immunoassay based on LRSP-enhanced fluorescence spectroscopy (LRSP-FS) was developed for the detection of aflatoxin M1 (AFM1) in milk. The biosensor allowed for the detection of AFM1 in milk at concentrations as low as 0.6 pg mL-1, which is about two orders of magnitude lower than the maximum AFM1 residue level in milk stipulated by the European Commission legislation.rnrnIn addition, LRSPs probe the medium adjacent to the metallic surface with more extended evanescent field than regular SPs. Therefore, three-dimensional binding matrices with up to micrometer thickness have been proposed for the immobilization of biomolecular recognition elements with large surface density that allows to exploit the whole evanescent field of LRSP. A photocrosslinkable carboxymethyl dextran (PCDM) hydrogel thin film is used as a binding matrix, and it is applied for the detection of free prostate specific antigen (f-PSA) based on the LRSP-FS and sandwich immunoassay. We show that this approach allows for the detection of f-PSA at low femto-molar range, which is approximately four orders of magnitude lower than that for direct detection of f-PSA based on the monitoring of binding-induced refractive index changes.rnrnHowever, a three dimensional hydrogel binding matrix with micrometer thickness can also serve as an optical waveguide. Based on the measurement of binding-induced refractive index changes, a hydrogel optical waveguide spectroscopy (HOWS) is reported for a label-free biosensor. This biosensor is implemented by using a SPR optical setup in which a carboxylated poly(N-isoproprylacrylamide) (PNIPAAm) hydrogel film is attached on a metallic surface and modified by protein catcher molecules. Compared to regular SPR biosensor with thiol self-assembled monolayer (SAM), HOWS provides an order of magnitude improved resolution in the refractive index measurements and enlarged binding capacity owing to its low damping and large swelling ratio, respectively. A model immunoassay experiment revealed that HOWS allowed detection of IgG molecules with a 10 pM limit of detection (LOD) that was five-fold lower than that achieved for SPR with thiol SAM. For the high capacity hydrogel matrix, the affinity binding was mass transport limited.rnrnThe mass transport of target molecules to the sensor surface can play as critical a role as the chemical reaction itself. In order to overcome the diffusion-limited mass transfer, magnetic iron oxide nanoparticles were employed. The magnetic nanoparticles (MNPs) can serve both as labels providing enhancement of the refractive index changes, and “vehicles” for rapidly delivering the analytes from sample solution to an SPR sensor surface with a gradient magnetic field. A model sandwich assay for the detection of β human chorionic gonadotropin (βhCG) has been utilized on a gold sensor surface with metallic diffraction grating structure supporting the excitation of SPs. Various detection formats including a) direct detection, b) sandwich assay, c) MNPs immunoassay without and d) with applied magnetic field were compared. The results show that the highly-sensitive MNPs immunoassay improves the LOD on the detection of βhCG by a factor of 5 orders of magnitude with respect to the direct detection.rn

Advanced schemes for surface plasmon resonance and plasmon-enhanced fluorescence biosensors

Advanced optical biosensor platforms exploiting long range surface plasmons (LRSPs) and responsive N-isopropylacrylamide (NIPAAm) hydrogel binding matrix for the detection of protein and bacterial pathogen analytes were carried out. LRSPs are optical waves that originate from coupling of surface plasmons on the opposite sites of a thin metallic film embedded between two dielectrics with similar refractive indices. LRSPs exhibit orders of magnitude lower damping and more extended profile of field compared to regular surface plasmons (SPs). Their excitation is accompanied with narrow resonance and provides stronger enhancement of electromagnetic field intensity that can advance the sensitivity of surface plasmon resonance (SPR) and surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) biosensors. Firstly, we investigated thin gold layers deposited on fluoropolymer surface for the excitation of LRSPs. The study indicates that the morphological, optical and electrical properties of gold film can be changed by the surface energy of fluoropolymer and affect the performance of a SPFS biosensor. A photo-crosslinkable NIPAAm hydrogel was grafted to the sensor surface in order to serve as a binding matrix. It was modified with bio-recognition elements (BREs) via amine coupling chemistry and offered the advantage of large binding capacity, stimuli responsive properties and good biocompatibility. Through experimental observations supported by numerical simulations describing diffusion mass transfer and affinity binding of target molecules in the hydrogel, the hydrogel binding matrix thickness, concentration of BREs and the profile of the probing evanescent field was optimized. Hydrogel with a up to micrometer thickness was shown to support additional hydrogel optical waveguide (HOW) mode which was employed for probing affinity binding events in the gel by means of refractometric and fluorescence measurements. These schemes allow to reach limits of detection (LODs) at picomolar and femtomolar levels, respectively. Besides hydrogel based experiments for detection of molecular analytes, long range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy (LRSP-FS) was employed for detection of bacterial pathogens. The influence of capture efficiency of bacteria on surfaces and the profile of the probing field on sensor response were investigated. The potential of LRSP-FS with extended evanescent field is demonstrated for detection of pathogenic E. coli O157:H7 on sandwich immunoassays . LOD as low as 6 cfu mL-1 with a detection time of 40 minutes was achieved.rn

Direct electron transfer to cytochrome c oxidase investigated by electrochemistry and time-resolved surface-enhanced infrared absorption spectroscopy

Cytochrom c Oxidase (CcO), der Komplex IV der Atmungskette, ist eine der Häm-Kupfer enthaltenden Oxidasen und hat eine wichtige Funktion im Zellmetabolismus. Das Enzym enthält vier prosthetische Gruppen und befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und in der Zellmembran einiger aerober Bakterien. Die CcO katalysiert den Elektronentransfer (ET) von Cytochrom c zu O2, wobei die eigentliche Reaktion am binuklearen Zentrum (CuB-Häm a3) erfolgt. Bei der Reduktion von O2 zu zwei H2O werden vier Protonen verbraucht. Zudem werden vier Protonen über die Membran transportiert, wodurch eine elektrochemische Potentialdifferenz dieser Ionen zwischen Matrix und Intermembranphase entsteht. Trotz ihrer Wichtigkeit sind Membranproteine wie die CcO noch wenig untersucht, weshalb auch der Mechanismus der Atmungskette noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Das Ziel dieser Arbeit ist, einen Beitrag zum Verständnis der Funktion der CcO zu leisten. Hierzu wurde die CcO aus Rhodobacter sphaeroides über einen His-Anker, der am C-Terminus der Untereinheit II angebracht wurde, an eine funktionalisierte Metallelektrode in definierter Orientierung gebunden. Der erste Elektronenakzeptor, das CuA, liegt dabei am nächsten zur Metalloberfläche. Dann wurde eine Doppelschicht aus Lipiden insitu zwischen die gebundenen Proteine eingefügt, was zur sog. proteingebundenen Lipid-Doppelschicht Membran (ptBLM) führt. Dabei musste die optimale Oberflächenkonzentration der gebundenen Proteine herausgefunden werden. Elektrochemische Impedanzspektroskopie(EIS), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und zyklische Voltammetrie (CV) wurden angewandt um die Aktivität der CcO als Funktion der Packungsdichte zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit betrifft die Untersuchung des direkten ET zur CcO unter anaeroben Bedingungen. Die Kombination aus zeitaufgelöster oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptionsspektroskopie (tr-SEIRAS) und Elektrochemie hat sich dafür als besonders geeignet erwiesen. In einer ersten Studie wurde der ET mit Hilfe von fast scan CV untersucht, wobei CVs von nicht-aktivierter sowie aktivierter CcO mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen wurden. Die aktivierte Form wurde nach dem katalytischen Umsatz des Proteins in Anwesenheit von O2 erhalten. Ein vier-ET-modell wurde entwickelt um die CVs zu analysieren. Die Methode erlaubt zwischen dem Mechanismus des sequentiellen und des unabhängigen ET zu den vier Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB zu unterscheiden. Zudem lassen sich die Standardredoxpotentiale und die kinetischen Koeffizienten des ET bestimmen. In einer zweiten Studie wurde tr-SEIRAS im step scan Modus angewandt. Dafür wurden Rechteckpulse an die CcO angelegt und SEIRAS im ART-Modus verwendet um Spektren bei definierten Zeitscheiben aufzunehmen. Aus diesen Spektren wurden einzelne Banden isoliert, die Veränderungen von Vibrationsmoden der Aminosäuren und Peptidgruppen in Abhängigkeit des Redoxzustands der Zentren zeigen. Aufgrund von Zuordnungen aus der Literatur, die durch potentiometrische Titration der CcO ermittelt wurden, konnten die Banden versuchsweise den Redoxzentren zugeordnet werden. Die Bandenflächen gegen die Zeit aufgetragen geben dann die Redox-Kinetik der Zentren wieder und wurden wiederum mit dem vier-ET-Modell ausgewertet. Die Ergebnisse beider Studien erlauben die Schlussfolgerung, dass der ET zur CcO in einer ptBLM mit größter Wahrscheinlichkeit dem sequentiellen Mechanismus folgt, was dem natürlichen ET von Cytochrom c zur CcO entspricht.

Oberflächenplasmonen-artige Resonanzen auf metallischen Gittern

Die Geometrie einer Metalloberfläche bestimmt die Wechselwirkung zwischen der Oberflächenplasmonenresonanz und anderen Energieformen wie Photonen, anderen Oberflächenplasmonen und molekularen Anregungen. In dieser Arbeit wird der Einfluss dieser Effekte auf die optischen Eigenschaften von metallischen Reliefgittern untersucht.Aufgrund von Modellrechungen werden auf tiefen Gitterstrukturen Resonanzen erwartet, die sich als selbstgekoppelte Oberflächenplasmonen interpretieren lassen. Diese Resonanzen wurden aufgrund der Symmetrie des elektromagnetischen Feldes klassifiziert. Es wurden tiefe Gitter mit unterschiedlichen Profilformen hergestellt, die die experimentelle Beobachtung von drei gekoppelten Resonanzen erlauben. Variationen in der Tiefe und Asymmetrie der Gitter sowie in der experimentellen Geometrie zeigen die theoretisch vorausgesagten Effekte.Fluoreszenzfarbstoffe können mit elektromagnetischen Oberflächenresonanzen Energie austauschen. Die Lokalisierung des elektrischen Feldes von gekoppelten Resonanzen führt zu einer Ortsabhängigkeit der Kopplung, die bei 'freien' Oberflächenplasmonen nicht beobachtet wird. Ein theoretisches Modell ist in der Lage, die experimentellen Befunde weitgehend zu beschreiben. Die Ortsabhägigkeit der photochemischen Zerstörungsrate erlaubt die Anwendung dieses Effektes zur Messung von Diffusionsphänomenen in dünnen Filmen.Des weiteren wurde die Polarisationsabhängigkeit der Anregung von Oberflächenplasmonen wurde in konischer Reflexionsgeometrie und die Rolle der Oberflächenplasmonen in der thermisch induzierten Lichtemission untersucht. Ferner wurde eine vereinfachte Auswertungsroutine zur Anwendung von Gittern in der Untersuchung von dünnen dielektrischen Filmen entwickelt.

Confocal microscopy applied to the study of single entity fluorescence and light scattering

A sample scanning confocal optical microscope (SCOM) was designed and constructed in order to perform local measurements of fluorescence, light scattering and Raman scattering. This instrument allows to measure time resolved fluorescence, Raman scattering and light scattering from the same diffraction limited spot. Fluorescence from single molecules and light scattering from metallic nanoparticles can be studied. First, the electric field distribution in the focus of the SCOM was modelled. This enables the design of illumination modes for different purposes, such as the determination of the three-dimensional orientation of single chromophores. Second, a method for the calculation of the de-excitation rates of a chromophore was presented. This permits to compare different detection schemes and experimental geometries in order to optimize the collection of fluorescence photons. Both methods were combined to calculate the SCOM fluorescence signal of a chromophore in a general layered system. The fluorescence excitation and emission of single molecules through a thin gold film was investigated experimentally and modelled. It was demonstrated that, due to the mediation of surface plasmons, single molecule fluorescence near a thin gold film can be excited and detected with an epi-illumination scheme through the film. Single molecule fluorescence as close as 15nm to the gold film was studied in this manner. The fluorescence dynamics (fluorescence blinking and excited state lifetime) of single molecules was studied in the presence and in the absence of a nearby gold film in order to investigate the influence of the metal on the electronic transition rates. The trace-histogram and the autocorrelation methods for the analysis of single molecule fluorescence blinking were presented and compared via the analysis of Monte-Carlo simulated data. The nearby gold influences the total decay rate in agreement to theory. The gold presence produced no influence on the ISC rate from the excited state to the triplet but increased by a factor of 2 the transition rate from the triplet to the singlet ground state. The photoluminescence blinking of Zn0.42Cd0.58Se QDs on glass and ITO substrates was investigated experimentally as a function of the excitation power (P) and modelled via Monte-Carlo simulations. At low P, it was observed that the probability of a certain on- or off-time follows a negative power-law with exponent near to 1.6. As P increased, the on-time fraction reduced on both substrates whereas the off-times did not change. A weak residual memory effect between consecutive on-times and consecutive off-times was observed but not between an on-time and the adjacent off-time. All of this suggests the presence of two independent mechanisms governing the lifetimes of the on- and off-states. The simulated data showed Poisson-distributed off- and on-intensities, demonstrating that the observed non-Poissonian on-intensity distribution of the QDs is not a product of the underlying power-law probability and that the blinking of QDs occurs between a non-emitting off-state and a distribution of emitting on-states with different intensities. All the experimentally observed photo-induced effects could be accounted for by introducing a characteristic lifetime tPI of the on-state in the simulations. The QDs on glass presented a tPI proportional to P-1 suggesting the presence of a one-photon process. Light scattering images and spectra of colloidal and C-shaped gold nano-particles were acquired. The minimum size of a metallic scatterer detectable with the SCOM lies around 20 nm.

Optical resonances of sphere-on-plane geometries

The optical resonances of metallic nanoparticles placed at nanometer distances from a metal plane were investigated. At certain wavelengths, these “sphere-on-plane” systems become resonant with the incident electromagnetic field and huge enhancements of the field are predicted localized in the small gaps created between the nanoparticle and the plane. An experimental architecture to fabricate sphere-on-plane systems was successfully achieved in which in addition to the commonly used alkanethiols, polyphenylene dendrimers were used as molecular spacers to separate the metallic nanoparticles from the metal planes. They allow for a defined nanoparticle-plane separation and some often are functionalized with a chromophore core which is therefore positioned exactly in the gap. The metal planes used in the system architecture consisted of evaporated thin films of gold or silver. Evaporated gold or silver films have a smooth interface with their substrate and a rougher top surface. To investigate the influence of surface roughness on the optical response of such a film, two gold films were prepared with a smooth and a rough side which were as similar as possible. Surface plasmons were excited in Kretschmann configuration both on the rough and on the smooth side. Their reflectivity could be well modeled by a single gold film for each individual measurement. The film has to be modeled as two layers with significantly different optical constants. The smooth side, although polycrystalline, had an optical response that was very similar to a monocrystalline surface while for the rough side the standard response of evaporated gold is retrieved. For investigations on thin non-absorbing dielectric films though, this heterogeneity introduces only a negligible error. To determine the resonant wavelength of the sphere-on-plane systems a strategy was developed which is based on multi-wavelength surface plasmon spectroscopy experiments in Kretschmann-configuration. The resonant behavior of the system lead to characteristic changes in the surface plasmon dispersion. A quantitative analysis was performed by calculating the polarisability per unit area /A treating the sphere-on-plane systems as an effective layer. This approach completely avoids the ambiguity in the determination of thickness and optical response of thin films in surface plasmon spectroscopy. Equal area densities of polarisable units yielded identical response irrespective of the thickness of the layer they are distributed in. The parameter range where the evaluation of surface plasmon data in terms of /A is applicable was determined for a typical experimental situation. It was shown that this analysis yields reasonable quantitative agreement with a simple theoretical model of the sphere-on-plane resonators and reproduces the results from standard extinction experiments having a higher information content and significantly increased signal-to-noise ratio. With the objective to acquire a better quantitative understanding of the dependence of the resonance wavelength on the geometry of the sphere-on-plane systems, different systems were fabricated in which the gold nanoparticle size, type of spacer and ambient medium were varied and the resonance wavelength of the system was determined. The gold nanoparticle radius was varied in the range from 10 nm to 80 nm. It could be shown that the polyphenylene dendrimers can be used as molecular spacers to fabricate systems which support gap resonances. The resonance wavelength of the systems could be tuned in the optical region between 550 nm and 800 nm. Based on a simple analytical model, a quantitative analysis was developed to relate the systems’ geometry with the resonant wavelength and surprisingly good agreement of this simple model with the experiment without any adjustable parameters was found. The key feature ascribed to sphere-on-plane systems is a very large electromagnetic field localized in volumes in the nanometer range. Experiments towards a quantitative understanding of the field enhancements taking place in the gap of the sphere-on-plane systems were done by monitoring the increase in fluorescence of a metal-supported monolayer of a dye-loaded dendrimer upon decoration of the surface with nanoparticles. The metal used (gold and silver), the colloid mean size and the surface roughness were varied. Large silver crystallites on evaporated silver surfaces lead to the most pronounced fluorescence enhancements in the order of 104. They constitute a very promising sample architecture for the study of field enhancements.

Functional hydrogels

Hydrogels are used in a variety of applications in daily life, such as super absorbers, contact lenses and in drug delivery. Functional hydrogels that allow the incorporation of additional functionalities have enormous potential for future development. The properties of such hydrogels can be diversified by introducing responsiveness to external stimuli. These crosslinked polymers are known to respond to changes in temperature, pH and pressure, as well as chemical and electrical stimuli, magnetic fields and irradiation. From this responsive behavior possible applications arise in many fields like drug delivery, tissue engineering, purification and implementation as actuators, biosensors or for medical coatings. However, their interaction with biomaterial and way of functioning are yet not fully understood. Therefore, thorough investigations regarding their optical, mechanical and chemical nature have to be conducted. A UV-crosslinkable polymer, consisting of N-isopropylacrylamide, methacrylic acid and the UV-crosslinker 4-benzoylphenyl methacrylate was synthesized. Its composition, determined by a comprehensive NMR study, is equivalent to the composition of the monomer mixture. The chemical characteristics were preserved during the subsequently formation of hydrogel films by photo-crosslinking as proved by XPS. For the optical characterization, e.g. the degree of swelling of very thin films, the spectroscopy of coupled long range surface plasmons is introduced. Thicker films, able to guide light waves were analyzed with combined surface plasmon and optical waveguide mode spectroscopy (SPR/OWS). The evaluation of the data was facilitated by the reverse Wentzel-Kramers-Brillouin (WKB) approximation. The meshsize and proper motion of the surface anchored hydrogels were investigated by fluorescence correlation spectroscopy (FCS), micro photon correlation spectroscopy (µPCS) and SPR/OWS. The studied gels exhibit a meshsize that allowed for the diffusion of small biomolecules inside their network. For future enhancement of probing diffusants, a dye that enables FRET in FCS was immobilized in the gel and the diffusion of gold-nanoparticles embedded in the polymer solution was studied by PCS. These properties can be conveniently tuned by the crosslinking density, which depends on the irradiation dose. Additionally, protocols and components for polymer analogous reactions based on active ester chemistry of the hydrogel were developed. Based on these syntheses and investigations, the hydrogel films are applied in the fields of medical coatings as well as in biosensing as matrix and biomimetic cushion. Their non-adhesive properties were proved in cell experiments, SPR/OWS and ToF-SIMS studies. The functionality and non-fouling property of the prepared hydrogels allowed for adaption to the needs of the respective application.

Messung dynamischer Prozesse in der Nähe von Grenzflächen mit Hilfe neu entwickelter Lichtstreumethoden

Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung und Erprobung zweier neuer dynamischer Lichtstreumethoden: Die Resonanz verstärkte Lichtstreuung (REDLS: resonance enhanced dynamic light scattering) und die Wellenleiter verstärkte Lichtstreuung (WEDLS: waveguide enhanced dynamic light scattering). Beide Methoden verwenden eine Kombination aus evaneszenten Wellen und dynamischer Lichtstreuung: Bei der REDLS-Technik wird das evaneszentes Feld eines Oberflächenplasmons verwendet, bei der WEDLS-Technik handelt es sich um das evaneszente Feld von Metallfilm verstärkten Leckwellenleitermoden. Die neuen Methoden liefern Informationen über die Dynamik an Grenzflächen über ein breites Zeitfenster (einige Nanosekunden bis hin zu mehreren Sekunden) mit einer räumlichen Auflösung im sub-Mikrometerbereich. Sie erweitern somit das Gebiet der dynamischen Lichtstreuung in evaneszenter Geometrie, bei dem bislang nur die evanescent wave dynamic light scattering (EWDLS) - Technik zur Verfügung stand. Bei der EWDLS-Technik wird das evaneszente Feld der Totalreflexion als kohärenter Lichtstrahl für die dynamische Lichtstreuung verwendet. Ein Vergleich mit der EWDLS-Technik zeigt ein stark erhöhtes Signal/Rausch-Verhältnis bei den neu entwickelten Techniken aufgrund der resonanten Anregung. Zusätzlich ist es sowohl bei der REDLS- als auch bei der WEDLS-Technik möglich Grenzflächenmodifikationen und damit z.B. Adsorptionsprozesse zu detektieren. Der Einfluss einer Grenzfläche auf die Diffusion von PS-Latex-Partikeln wurde untersucht. Die Grenzfläche bestand im Fall der REDLS-Technik aus Gold, bei der WEDLS-Technik aus PMMA. Die Funktionsweise und die Gültigkeit der neu entwickelten Techniken wurde mit Hilfe von PS-Latex-Partikeln mit hydrodynamischen Radien von R =11nm bis hin zu R=204nm demonstriert.

Individual plasmonic nanogaps : controlled assembly and detailed investigation

Diese Arbeit befasst sich mit den optischen Resonanzen metallischer Nanopartikel im Abstand weniger Nanometer von einer metallischen Grenzfläche. Die elektromagnetische Wechselwirkung dieser „Kugel-vor-Fläche“ Geometrie ruft interessante optische Phänomene hervor. Sie erzeugt eine spezielle elektromagnetische Eigenmode, auch Spaltmode genannt, die im Wesentlichen auf den Nanospalt zwi-schen Kugel und Oberfläche lokalisiert ist. In der quasistatischen Näherung hängt die Resonanzposition nur vom Material, der Umgebung, dem Film-Kugel Abstand und dem Kugelradius selbst ab. Theoretische Berechnungen sagen für diese Region unter Resonanzbedingungen eine große Verstärkung des elektro-magnetischen Feldes voraus. rnUm die optischen Eigenschaften dieser Systeme zu untersuchen, wurde ein effizienter plasmonenver-mittelnder Dunkelfeldmodus für die konfokale Rastermikroskopie durch dünne Metallfilme entwickelt, der die Verstärkung durch Oberflächenplasmonen sowohl im Anregungs- als auch Emissionsprozess ausnutzt. Dadurch sind hochwertige Dunkelfeldaufnahmen durch die Metallfilme der Kugel-vor-Fläche Systeme garantiert, und die Spektroskopie einzelner Resonatoren wird erleichtert. Die optischen Untersuchungen werden durch eine Kombination von Rasterkraft- und Rasterelektronenmikroskopie vervollständigt, so dass die Form und Größe der untersuchten Resonatoren in allen drei Dimensionen bestimmt und mit den optischen Resonanzen korreliert werden können. Die Leistungsfähigkeit des neu entwickelten Modus wird für ein Referenzsystem aus Polystyrol-Kugeln auf einem Goldfilm demonstriert. Hierbei zeigen Partikel gleicher Größe auch die erwartete identische Resonanz.rnFür ein aus Gold bestehendes Kugel-vor-Fläche System, bei dem der Spalt durch eine selbstorganisierte Monolage von 2-Aminoethanthiol erzeugt wird, werden die Resonanzen von Goldpartikeln, die durch Reduktion mit Chlorgoldsäure erzeugt wurden, mit denen von idealen Goldkugeln verglichen. Diese ent-stehen aus den herkömmlichen Goldpartikeln durch zusätzliche Bestrahlung mit einem Pikosekunden Nd:Yag Laser. Bei den unbestrahlten Partikeln mit ihrer Unzahl an verschiedenen Formen zeigen nur ein Drittel der untersuchten Resonatoren ein Verhalten, das von der Theorie vorhergesagt wird, ohne das dies mit ihrer Form oder Größe korrelieren würde. Im Fall der bestrahlten Goldkugeln tritt eine spürbare Verbesserung ein, bei dem alle Resonatoren mit den theoretischen Rechnungen übereinstimmen. Eine Änderung der Oberflächenrauheit des Films zeigt hingegen keinen Einfluß auf die Resonanzen. Obwohl durch die Kombination von Goldkugeln und sehr glatten Metallfilmen eine sehr definierte Probengeometrie geschaffen wurde, sind die experimentell bestimmten Linienbreiten der Resonanzen immer noch wesentlich größer als die berechneten. Die Streuung der Daten, selbst für diese Proben, deutet auf weitere Faktoren hin, die die Spaltmoden beeinflußen, wie z.B. die genaue Form des Spalts. rnDie mit den Nanospalten verbundenen hohen Feldverstärkungen werden untersucht, indem ein mit Farbstoff beladenes Polyphenylen-Dendrimer in den Spalt eines aus Silber bestehenden Kugel-vor-Fläche Systems gebracht wird. Das Dendrimer in der Schale besteht lediglich aus Phenyl-Phenyl Bindungen und garantiert durch die damit einhergende Starrheit des Moleküls eine überragende Formstabiliät, ohne gleichzeitig optisch aktiv zu sein. Die 16 Dithiolan Endgruppen sorgen gleichzeitig für die notwendige Affinität zum Silber. Dadurch kann der im Inneren befindliche Farbstoff mit einer Präzision von wenigen Nanometern im Spalt zwischen den Metallstrukturen platziert werden. Der gewählte Perylen Farbstoff zeichnet sich wiederum durch hohe Photostabilität und Fluoreszenz-Quantenausbeute aus. Für alle untersuchten Partikel wird ein starkes Fluoreszenzsignal gefunden, das mindestens 1000-mal stärker ist, als das des mit Farbstoff überzogenen Metallfilms. Das Profil des Fluoreszenz-Anregungsspektrums variiert zwischen den Partikeln und zeigt im Vergleich zum freien Farbstoff eine zusätzliche Emission bei höheren Frequenzen, was in der Literatur als „hot luminescence“ bezeichnet wird. Bei der Untersuchung des Streuverhaltens der Resonatoren können wieder zwei unterschiedliche Arten von Resonatoren un-terschieden werden. Es gibt zunächst die Fälle, die bis auf die beschriebene Linienverbreiterung mit einer idealen Kugel-vor-Fläche Geometrie übereinstimmen und dann andere, die davon stark abweichen. Die Veränderungen der Fluoreszenz-Anregungsspektren für den gebundenen Farbstoffs weisen auf physikalische Mechanismen hin, die bei diesen kleinen Metall/Farbstoff Abständen eine Rolle spielen und die über eine einfache wellenlängenabhängige Verstärkung hinausgehen.

New enhancement strategies for plasmon-enhanced fluorescence biosensors

This thesis investigates metallic nanostructures exhibiting surface plasmon resonance for the amplification of fluorescence signal in sandwich immunoassays. In this approach, an analyte is captured by an antibody immobilized on a plasmonic structure and detected by a subsequently bound fluorophore labeled detection antibody. The highly confined field of surface plasmons originates from collective charge oscillations which are associated with high electromagnetic field enhancements at the metal surface and allow for greatly increased fluorescence signal from the attached fluorophores. This feature allows for improving the signal-to-noise ratio in fluorescence measurements and thus advancing the sensitivity of the sensor platform. In particular, the thesis presents two plasmonic nanostructures that amplify fluorescence signal in devices that rely on epifluorescence geometry, in which the fluorophore absorbs and emits light from the same direction perpendicular to the substrate surface.rnThe first is a crossed relief gold grating that supports propagating surface plasmon polaritons (SPPs) and second, gold nanoparticles embedded in refractive index symmetric environment exhibiting collective localized surface plasmons (cLSPs). Finite-difference time-domain simulations are performed in order to design structures for the optimum amplification of established Cy5 and Alexa Fluor 647 fluorophore labels with the absorption and emission wavelengths in the red region of spectrum. The design takes into account combined effect of surface plasmon-enhanced excitation rate, directional surface plasmon-driven emission and modified quantum yield for characteristic distances in immunoassays. Homebuilt optical instruments are developed for the experimental observation of the surface plasmon mode spectrum, measurements of the angular distribution of surface plasmon-coupled fluorescence light and a setup mimicking commercial fluorescence reading systems in epifluorescence geometry.rnCrossed relief grating structures are prepared by interference lithography and multiple copies are made by UV nanoimprint lithography. The fabricated crossed diffraction gratings were utilized for sandwich immunoassay-based detection of the clinically relevant inflammation marker interleukin 6 (IL-6). The enhancement factor of the crossed grating reached EF=100 when compared to a flat gold substrate. This result is comparable to the highest reported enhancements to date, for fluorophores with relatively high intrinsic quantum yield. The measured enhancement factor excellently agrees with the predictions of the simulations and the mechanisms of the enhancement are explained in detail. Main contributions were the high electric field intensity enhancement (30-fold increase) and the directional fluorescence emission at (4-fold increase) compared to a flat gold substrate.rnCollective localized surface plasmons (cLSPs) hold potential for even stronger fluorescence enhancement of EF=1000, due to higher electric field intensity confinement. cLSPs are established by diffractive coupling of the localized surface plasmon resonance (LSPR) of metallic nanoparticles and result in a narrow resonance. Due to the narrow resonance, it is hard to overlap the cLSPs mode with the absorption and emission bands of the used fluorophore, simultaneously. Therefore, a novel two resonance structure that supports SPP and cLSP modes was proposed. It consists of a 2D array of cylindrical gold nanoparticles above a low refractive index polymer and a silver film. A structure that supports the proposed SPP and cLSP modes was prepared by employing laser interference lithography and the measured mode spectrum was compared to simulation results.rn