On the cellular stress response to Staphylococcus aureus alpha-toxin

Staphylococcus aureus alpha-hemolysin was the first bacterial toxin recognized to form pores in the plasma membrane of eukaryotic cells. It is secreted as a water-soluble monomer that upon contact with target membranes forms an amphiphatic heptameric beta-barrel which perforates the bilayer. As a consequence, red cells undergo colloidosmotic lyses, while some nucleated cells may succumb to necrosis or programmed cell death. However, most cells are capable of repairing a limited number of membrane lesions, and then respond with productive transcriptional activation of NF-kB. In the present study, by using microarray and semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), data from a previously performed serial analysis of gene expression (SAGE) were extended and verified, revealing that immediate early genes (IEGs) such as c-fos, c-jun and egr-1 are strongly induced at 2-8 h after transient toxin treatment. Activating protein 1 (AP-1: c-Fos, c-Jun) binding activity was increased accordingly. As IEGs are activated by growth factors, these findings led to the discovery that ���-toxin promotes cell cycle progression of perforated cells in an EGFR-dependent fashion. Although the amount of c-fos mRNA rose rapidly after toxin treatment, c-Fos protein expression was observed only after a lag of about 3 h. Since translation consumes much ATP, which transiently drops after transient membrane perforation, the suspicion arised that membrane-perforation caused global, but temporary downregulation of translation. In fact, eIF2�� became heavily phosphorylated minutes after cells had been confronted with the toxin, resulting in shutdown of protein synthesis before cellular ATP levels reached the nadir. GCN2 emerged as a candidate eIF2�� kinase, since its expression rapidly increased in toxin-treated cells. Two hours after toxin treatment, GADD34 transcripts, encoding a protein that targets the catalytic subunit of protein phosphatase 1 (PP1) to the endoplasmic reticulum, were overexpressed. This was followed by dephosphorylation of eIF2�� and resumption of protein synthesis. Addition of tautomycetin, a specific inhibitor of PP1, led to marked hyperphosphorylation of eIF2�� and significantly reduced the drop of ATP-levels in toxin-treated cells. A novel link between two major stress-induced signalling pathways emerged when it was found that both translational arrest and restart were under the control of stress-activated protein kinase (SAPK) p38. The data provide an explanation for the indispensible role of p38 for defence against the archetypal threat of membrane perforation by agents that produce small transmembrane-pores.

Induktion von Pro-Autophagie-Signalen durch einen extra- oder intrazellul��ren Alpha-Toxin-Angriff

Autophagie ist ein konservierter, kataboler Mechanismus in allen eukaryoten Zellen. Unter anderem wird ihm eine wichtige Rolle als zellautonomer Abwehrmechanismus gegen Mikroorganismen zugeschrieben; von manchen Infektionserregern wird er jedoch unterlaufen oder sogar genutzt. Der st��rkste Ausl��ser der Autophagie ist ein Mangel an N��hrstoffen, insbesondere Aminos��uren. ��ber die Deaktivierung der Kinase mTORC1 und die Phosphorylierung des eukaryoten Translationsinitiationsfaktors eIF2�� hemmt die N��hrstoffknappheit die Proteinbiosynthese und aktiviert gleichzeitig Autophagie. Wie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Autophagie ausl��sen oder manipulieren, ist derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Modifikationen an Mikroben oder Phagosomen und Adapterproteine, die diese Ver��nderungen und Komponenten des Autophagieapparates erkennen, scheinen jedenfalls bei der selektiven Erkennung durch die Autophagie-Maschinerie wichtig zu sein. rnIn der vorliegenden Dissertationsarbeit wird die Rolle des membranporenbildenden ��-Toxins von Staphylococcus aureus f��r die Induktion von Autophagie beleuchtet. Zum einen erwies sich die Akkumulation von (EGFP)-LC3(II), einem Marker der Autophagosomen, um intrazellul��re S. aureus als abh��ngig von ��-Toxin. Zweitens, gen��gt extrazellul��r appliziertes ��-Toxin um (EGFP)-LC3(II)-positive Endosomen zu induzieren. W��hrend der Angriff aus dem extrazellul��ren Raum jedoch binnen kurzer Zeit eine fokale Kumulation von phosphoryliertem eIF2�� an der Plasmamembran induziert, die an der Internalisierung des Toxins beteiligt ist, findet sich am phagosomalen Kompartiment keine Toxin-abh��ngige Anh��ufung von p-eIF2�� oder proximalen Autophagieregulatoren. Dies impliziert, dass Toxin-Angriff auf die Plasmamembran, nicht aber auf das Phagosom, zu einer Reaktion f��hrt, wie sie bei massivem N��hrstoffmangel zu beobachten ist. Obwohl keine ��-Toxin-abh��ngige Kumulation von p-eIF2�� bei einem Angriff aus dem Phagosom erfolgt, findet sich um ��-Toxin-produzierende Bakterien eine massive Kumulation von LC3 und Adapterprotein p62/Sequestosome1. Dies deutet daraufhin, dass der Ort des Angriffs - Plasmamembran oder Phagosom ��� f��r den Autophagie-induzierenden Mechanismus wichtig sein k��nnte. Der unterschiedliche Effekt auf die zellul��ren Ionenkonzentrationen, den ein Angriff auf die Plasmamembran oder auf ein Phagosom ausl��sen w��rde, bietet hierf��r eine m��gliche Erkl��rung. Die Aktivierung der Autophagie ��ber Adapterproteine k��nnte dann als back-up Mechanismus fungieren, der auch dann greift, wenn eine Invasion ohne Sch��digung der Plasmamembran erfolgt. Ein cross-talk der beiden Induktionswege ist angesichts der Bedeutung von p62 f��r die selektive und die Hunger-assoziierte Autophagie gut m��glich; sezerniertes Toxin k��nnte durch die Aktivierung der basalen Autophagie Adapter-basierte Mechanismen verst��rken.

Die Verbindung von Kleinwinkelstreuung und in silico-Methodik zur Aufkl��rung von Konformationswechseln gro��er Proteinkomplexe

In dieser Dissertation wurden die Methoden Homologiemodellierung und Molekulardynamik genutzt, um die Struktur und das Verhalten von Proteinen in L��sung zu beschreiben. Mit Hilfe der R��ntgenkleinwinkelstreuung wurden die mit den Computermethoden erzeugten Vorhersagen verifiziert. F��r das alpha-H��molysin, ein Toxin von Staphylococcus aureus, das eine heptamere Pore formen kann, wurde erstmalig die monomere Struktur des Protein in L��sung beschrieben. Homologiemodellierung auf Basis verwandter Proteine, deren monomere Struktur bekannt war, wurde verwendet, um die monomere Struktur des Toxins vorherzusagen. Flexibilit��t von Strukturelementen in einer Molekulardynamiksimulation konnte mit der Funktionalit��t des Proteines korreliert werden: Intrinsische Flexibilit��t versetzt das Protein in die Lage den Konformationswechsel zur Pore nach Assemblierung zu vollziehen. R��ntgenkleinwinkelstreuung bewies die Unterschiede der monomeren Struktur zu den Strukturen der verwandten Proteine und belegt den eigenen Vorschlag zur Struktur. ��berdies konnten Arbeiten an einer Mutante, die in einer sogenannten Pr��porenkonformation arretiert und nicht in der Lage ist eine Pore zu formen, zeigen, dass dieser ��bergangszustand mit der Rotationsachse senkrecht zur Membran gelagert ist. Eine geometrische Analyse beweist, dass es sterisch m��glich ist ausgehend von dieser Konformation die Konformation der Pore zu erreichen. Eine energetische und kinetische Analyse dieses Konformationswechsels steht noch aus. Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit den Konformationswechseln von H��mocyaninen. Diese wurden experimentell mittels R��ntgenkleinwinkelstreuung verfolgt. Konformationswechsel im Zusammenhang mit der Oxygenierung konnten f��r die 24meren H��mocyanine von Eurypelma californicum und Pandinus imperator beschrieben werden. F��r eine Reihe von H��mocyaninen ist nachgewiesen, dass sie unter Einfluss des Agenz SDS Tyrosinaseaktivit��t entfalten k��nnen. Der Konformationswechsel der H��mocyanine von E. californicum und P. imperator bei der Aktivierung zur Tyrosinase mittels SDS wurde experimentell best��tigt und die Stellung der Dodekamere der H��mocyanine als wesentlich bei der Aktivierung festgestellt. Im Zusammenhang mit anderen Arbeiten gilt damit die Relaxierung der Struktur unter SDS-Einfluss und der sterische Einfluss auf die verbindenden Untereinheiten b & c als wahrscheinliche Ursache f��r die Aktivierung zur Tyrosinase. Eigene Software zum sogenannten rigid body-Modellierung auf der Basis von R��ntgenkleinwinkelstreudaten wurde erstellt, um die Streudaten des hexameren H��mocyanins von Palinurus elephas und Palinurus argus unter Einfluss der Effektoren Urat und Koffein strukturell zu interpretieren. Die Software ist die erste Implementierung eines Monte Carlo-Algorithmus zum rigid body-Modelling. Sie beherrscht zwei Varianten des Algorithmus: In Verbindung mit simulated annealing k��nnen wahrscheinliche Konformationen ausgefiltert werden und in einer anschlie��enden systematischen Analyse kann eine Konformation geometrisch beschrieben werden. Andererseits ist ein weiterer, reiner Monte Carlo-Algorithmus in der Lage die Konformation als Dichteverteilung zu beschreiben.

Clostridium difficile: Entdeckung und Charakterisierung der autokatalytischen Prozessierung von Toxin B

Clostridium difficile, der Ausl��ser der nosokomialen Antibiotika-assoziierten Durchf��lle und der Pseudomembran��sen Kolitis, besitzt zwei Hauptvirulenzfaktoren: die Toxine A und B. In vorangegangenen Ver��ffentlichungen wurde gezeigt, dass Toxin B durch einen zytosolischen Faktor der eukaryotischen Zielzelle w��hrend des Aufnahmeweges in die Zelle gespalten wird. Nur die N-terminale katalytische Dom��ne erreicht das Zytosol. Hierbei wurde davon ausgegangen, dass eine Protease der Zielzelle die Spaltung katalysiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Spaltung von Toxin B ein intramolekularer Prozess ist, der zytosolisches Inositolphosphat der Zielzelle als Kofaktor zur Aktivierung der intrinsischen Protease ben��tigt. Die Freisetzung der katalytischen Dom��ne durch Inositolphosphat-induzierte Spaltung ist nicht nur das Prinzip des Clostridium difficile Toxin B sondern auch des Toxin A, als auch des alpha Toxin von Clostridium novyi und das Letale Toxin von Clostridium sordellii. Der kovalente Inhibitor von Aspartatproteasen 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propan (EPNP), wurde dazu verwendet die intrinsische Protease von Toxin B zu blockieren und erm��glichte die Identifikation des katalytischen Zentrums. EPNP modifiziertes Toxin B verliert die intrinsische Proteaseaktivit��t und Zytotoxizit��t, aber wenn es direkt in das Zytosol der Wirtszelle injiziert ist, bleibt die Toxizit��t erhalten. Diese ist damit der erste Bericht eines bakteriellen Toxins, das eukaryotische Signale zur induzierten Autoproteolyse nutzt, um seine katalytisch-toxische Dom��ne in das Zytosol der Zielzelle freizusetzen. Durch diese Ergebnisse kann das Modell der Toxin-Prozessierung nun um einen weiteren entscheidenden Schritt vervollst��ndigt werden.

Untersuchung multimerer Proteinkomplexe mit oberfl��chenanalytischen und r��ntgenspektroskopischen Methoden

Zusammenfassung rnrnIn dieser Arbeit wurden Untersuchungen an zwei verschiedenen multimeren Proteinkomplexen durchgef��hrt: Zum einen am H��mocyanin aus Homarus americanus mittels R��ntgen-L-Kantenspektroskopie und zum anderen am ��-Toxin aus Staphylococcus aureus, hinsichtlich der Interaktion an speziellen Raft-artigen Membranabschnitten, mittels AFM.rnF��r das H��mocyanin aus Homarus americanus konnte ein neuer Aspekt bez��glich der Bindung von Sauerstoff aufgezeigt werden. Ein zuvor nicht in Betracht gezogener und diskutierter Einfluss von Wassermolek��len auf diesen Vorgang konnte mittels der Methode der R��ntgen-L-Kantenspektroskopie dargestellt werden. Erstmals war es m��glich die beiden verschiedenen Beladungszust��nde (Oxy-, Deoxy-Zustand) des H��mocyanin mittels dieser Methode in physiologisch ��hnlicher Umgebung zu untersuchen. Vergleiche der erhaltenen L-Kanten-Spektren mit denen anorganischer Vergleichsl��sungen lie��en auf eine Interaktion von Wassermolek��len mit den beiden Kupferatomen des aktiven Zentrums schlie��en. Dadurch wurde erstmals ein m��glicher Einfluss des Wassers auf den Oxygenierungsprozess des H��mocyanins auf elektronischer Ebene aufgezeigt. Vergleichende Betrachtungen von R��ntgenkristallstrukturen verschiedener Typ-3-Kupferproteine best��tigten, dass auch hier ein Einfluss von Wassermolek��len auf die aktiven Zentren m��glich ist. Vorgeschlagen wird dabei, dass an Stelle der ��berlappung der 3d-Orbitale des Kupfers mit den 2p-Orbitalen des Sauerstoffs, wie sie im sauerstoffbeladenen Zustand auftritt, im sauerstoffunbeladenen Zustand eine Wechselwirkung der 3d-Orbitale des Kupfers mit den LUMOS der Wassermolek��le m��glich wird, und ein Elektronen- bzw. Ladungstransfer von den Kupfern auf die Wassermolek��le erfolgen kann. rnAFM-Untersuchungen hinsichtlich der Interaktion des ��-Toxins aus Staphylococcus aureus mit oberfl��chenunterst��tzten Modellmembranen wiesen darauf hin, dass eine bevorzugte Anbindung und zumindest teilweise Integration der ��-Toxine in Raft-artige Membranbereiche stattfindet. F��r verschiedene tern��re Lipidsysteme konnten phasenseparierte Modellmembranen abgebildet und die unterschiedlichen Dom��nenformen zugeordnet werden. Der Anbindungsprozess der Toxine an diese oberfl��chenunterst��tzte Modellmembranen erfolgte dann wahrscheinlich vornehmlich an den speziellen Raft-artigen Dom��nen, wohingegen die Insertion der Poren vorrangig an den Grenzbereichen zwischen den Dom��nen auftrat. M��gliche Ursache daf��r sind die r��umlichen Besonderheiten dieser Grenzfl��chen. Membranen weisen an den Schnittstellen zwischen zwei Dom��nenformen eine erh��hte Unordnung auf, was sich u.a. in einer geringeren Packungsdichte der Phospholipide und dem erh��hten Freiheitsgrad ihrer Kopfgruppen bemerkbar macht. Au��erdem kommt es auf Grund der Interaktion der beteiligten Membranbestandteile Sphingomyelin und Cholesterol untereinander zu einer speziellen Ausrichtung der Phosphocholin-Kopfgruppen und innerhalb der Raft-artigen Dom��nen zu einer erh��hten Packungsdichte der Phospholipide. Die in dieser Arbeit pr��sentierten Ergebnisse unterst��tzten demnach die in der Literatur postulierte Vermutung der bevorzugten Interaktion und Integration der Toxin-Molek��le mit Raft-artigen Membrandom��nen. Die Insertion der Pore erfolgt aber wahrscheinlich bevorzugt an den Grenzbereichen zwischen den auftretenden Dom��nen.rn