Optische Mikroskopie an kolloidalen Suspensionen unter Nichtgleichgewichtsbedingungen

Kolloidale Suspensionen eignen sich aufgrund der für sierelevanten Längeskalen hervorragend zur Beobachtung mittelsoptischer Mikroskopie. Die Verwendung speziellerKontrastierverfahren kann bestimmte Aspekte kolloidalerStrukturen besonders hervorheben und eine verbesserteAnalyse von Nichtgleichgewichtszuständen in kolloidalenSystemen ermöglichen. Mittels Phasen- und Interferenzkontrast konnte die Ursachedes Kleinwinkelstreumaximums in der Lichtstreuung an einerSuspension aus Mikronetzteilchen auf die unterschiedlichenStrukturfaktoren von Kristall und Korngrenze zurückgeführtwerden.Der Zusammenhang von Struktur und Farbe eingetrockneterMultilagen wurde in hochauflösender Durchlichtmikroskopiedemonstriert und zur Analyse der inneren Struktur derKristalldomänen inklusive von Versetzungen und Stapelfehlernbenutzt.Mit der Polarisationsmikroskopie konnte die Veränderung derPartikelzahldichte um ein Ionentauscherbruchstück auf einenSalzkonzentrationsgradienten zurückgeführt werden. Die Untersuchung kolloidaler Suspensionen in einem Scherfeldmittels Fourier-Mikroskopie lieferte im Bereich fluiderGleichgewichtsstrukturen den Nachweis scherinduzierterhexagonaler Strukturen. Die Ultramikroskopie mit erweiterterSchärfentiefe ermöglichte die direkte Beobachtung desGleitmechanismus von verscherten hexagonalen Lagen und dieKlassifizierung durch die entwickelte2D-Partikelkorrelation. Die Scherung induziert in fluidenStrukturen hexagonale Ordnung und zerstört bei großenScherraten existierende Ordnung. Es wird eineWandstabilisierung der hexagonalen Strukturen beobachtet. Mittels Bragg-Mikroskopie konnte unter Scherung dieHomogenität der Struktur innerhalb der Scherzelledokumentiert werden sowie nach Scherung die Entstehung derGleichgewichts bcc Phase.

Untersuchungen zur Strahldynamik am Mainzer Mikrotron

Diese Arbeit untersucht die longitudinale und transversaleStrahldynamik am Mainzer Mikrotron MAMI. Die gemessenen Abbildungseigenschaften werden mit den Design-Rechnungen verglichen. Dadurch konnte die Strahlqualitaet von MAMI B und das Design der neuen HDSM Mikrotronstufe verbessert werden. Es wurde eine Stoerungsrechnung formuliert, um die 6-DAbbildungsmatrix entlang der Beschleunigungsstrecke zu berechnen. Ausgehend von der linearisierten Hamilton Funktion wird die Transfermatrix M in eine unendliche Summe ueber Matrizen M(n) zerlegt, die jeweils eine n-fache Wechselwirkung des Strahls mit dem Quadrupolanteil des Fuehrungsfeldes darstellen. Dank des tieferen Einblicks in die Auswirkung von Feldfehlern konnte damit das Mikrotron-Modell leicht an die gemessenen Transfermatrizen angepasst werden. Ferner wurde die Identifizierung und Korrektur anti-symmetrischer Feldfehler in den Mikrotron-Dipolen untersucht. Es wurde ein Messverfahren entwickelt, um kleine Feldkomponenten in der Bahnebene von der Groessenordnung 10E-3 zu erkennen. Das vorgeschlagene Verfahren wurde mit Hilfe des Simulationsprogramms TOSCA ausgetestet. Schliesslich wurde die Stabilitaet der Longitudinaloptik verbessert. Dadurch konnte eine hochpraezise Energiestabi-lisierung verwirklicht werden. Bei 855 MeV Strahlenergie wird eine Stabilitaet von etwa 10E-6 erreicht.

Proteins control in biomineralization processes of the freshwater pearl mussel Hyriopsis cumingii

Pearls are an amazing example of calcium carbonate biomineralization. They show a classic brick and mortar internal structure in which the predominant inorganic part is composed by aragonite and vaterite tablets. The organic matrix is disposed in concentric layers tightly associated to the mineral structures. Freshwater cultivate pearls (FWCPs) and shells nacreous layers of the Chinese mussel Hyriopsis cumingii were demineralized using an ion exchange resin in order to isolate the organic matrix. From both starting materials a soluble fraction was obtained and further analyzed. The major component of the soluble extracts was represented by a similar glycoprotein having a molecular weight of about 48 kDa in pearls and 44 kDa in shells. Immunolocalization showed their wide distribution in the organic sheet surrounding calcium carbonate tablets of the nacre and in the interlamellar and intertabular matrix. These acidic glycoprotein also contained inside the aragonite platelets, are direct regulators during biomineralization processes, participating to calcium carbonate precipitation since the nucleation step. Selective calcium carbonate polymorph precipitation was performed using the two extracts. The polysaccharides moiety was demonstrate to be a crucial factor in polymorphs selection. In particular, the higher content in sugar groups found in pearls extract was responsible of stabilization of the high energetic vaterite during the in vitro precipitation assay; while irregular calcite was obtained using shells protein. Furthermore these polypeptides showed a carbonic anhydrase activity that, even if not directly involved in polymorphs determination, is an essential regulator in CaCO3 formation by means of carbonate anions production. The structural and functional characterization of the proteins included in biocomposites, gives important hints for understanding the complicated process of biomineralization. A better knowledge of this natural mechanism can offer new strategies for producing environmental friendly materials with controlled structures and enhanced chemical-physical features.

Synthese und präklinische Evaluation von neuen antioxidativen Substanzen zur Neuroprotektion

Oxidativer Stress ist seit über 25 Jahren als ein Charakteristikum vieler pathologischer Prozesse bekannt. Helmut Sies beschrieb bereits in den 1980er Jahren oxidativen Stress als Störung in der prooxidativ – antioxidativen Balance zugunsten der prooxidativen Seite, wodurch es potentiell zu Schäden in verschiedenen Geweben kommt. Oxidativer Stress tritt sowohl bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und zerebraler Ischämie, bei peripheren Erkrankungen wie Arteriosklerose, als auch beim Alterungsprozess per se auf und wird als Ursache oder zumindest als ein krankheitsfördernder Faktor diskutiert. Die in in vitro-Experimenten als vielversprechend antioxidativ getesteten Substanzen (meist phenolhaltig) ergaben in mehreren klinischen Studien keinen signifikanten Vorteil. Um die Ursachen dieser Ergebnisse näher zu analysieren, wurde in der vorliegenden Arbeit auf Basis des cytoprotektiven Phenothiazins, einem aromatischen trizyklischen Amin, der Einfluss von verschiedenen Substituenten im Hinblick auf Lipophilie, Radikalstabilisierung und Löslichkeit des Moleküls chemisch vorhergesagt. Anhand dieser in silicio Struktur-Wirkungs-Beziehung wurden anschließend neue Modellsubstanzen synthetisiert, welche sich systematisch in den drei zuvor genannten Parametern unterschieden. Dies wurde durch Substitution von unterschiedlich langen Fettsäureketten, von löslichkeitsbeeinflussenden funktionellen Gruppen, oder durch Anellierung zusätzlicher aromatischer Ringe erreicht. In den folgenden Versuchen zu antioxidativer Kapazität, zellulärem Überleben, Lipidperoxidation und Proteinoxidation zeigte sich, dass mit gesteigerter Stabilität der korrespondierenden Radikale und mit wachsender Lipophilie die antioxidativ cytoprotektive Aktivität der neuen Derivate bis zu einer gewissen Grenze (logP ≈ 7) signifikant zunahm; über diesen Wert hinaus sank die Effektivität wieder ab. Benzanellierte Phenothiazine entwickelten mit EC50-Werten von ungefähr 8-10 nM die höchste mittlere effektive Wirkkonzentration in oxidativ geschädigten, klonalen hippocampalen Neuronen (HT-22 Zellen). Dies entspricht einer etwa 20-fachen Verbesserung gegenüber α-Tocopherol, welches bisher als bestes natürliches lipophiles Antioxidans angesehen wurde. Im Vergleich zu Phenothiazin erreichen die neuen Antioxidantien immerhin eine höhere Effektivität um den Faktor 4. Folglich sind es sowohl Aspekte der Löslichkeit und der Distribution, welche die Potenz der gegenwärtigen Antioxidantien limitieren als auch Aspekte der Radikalstabilisierung, die Einfluss auf die primäre Wirksamkeit nehmen. Dieses Wissen sollte beim zukünftigen Design neuer, antioxidativ potenter Moleküle im Hinblick auf ihren langfristigen Einsatz bei neurodegenerativen Erkrankungen von Nutzen sein.

Structure formation of amphiphilic molecules at the air,water interface and after film transfer

One of the basic concepts of molecular self-assembly is that the morphology of the aggregate is directly related to the structure and interaction of the aggregating molecules. This is not only true for the aggregation in bulk solution, but also for the formation of Langmuir films at the air/water interface. Thus, molecules at the interface do not necessarily form flat monomolecular films but can also aggregate into multilayers or surface micelles. In this context, various novel synthetic molecules were investigated in terms of their morphology at the air/water interface and in transferred films. rnFirst, the self-assembly of semifluorinated alkanes and their molecular orientation at the air/water interface and in transferred films was studied employing scanning force microscopy (SFM) and Kelvin potential force microscopy. Here it was found, that the investigated semifluorinated alkanes aggregate to form circular surface micelles with a diameter of 30 nm, which are constituted of smaller muffin-shaped subunits with a diameter of 10 nm. A further result is that the introduction of an aromatic core into the molecular structure leads to the formation of elongated surface micelles and thus implements a directionality to the self-assembly. rnSecond, the self-assembly of two different amphiphilic hybrid materials containing a short single stranded desoxyribonucleic acid (DNA) sequence was investigated at the air/water interface. The first molecule was a single stranded DNA (11mer) molecule with two hydrophobically modified 5-(dodec-1-ynyl)uracil nucleobases at the terminal 5'-end of the oligonucleotide sequence. Isotherm measurements revealed the formation of semi-stable films at the air/water interface. SFM imaging of films transferred via Langmuir-Blodgett technique supported this finding and indicated mono-, bi- and multilayer formation, according to the surface pressure applied upon transfer. Within these films, the hydrophilic DNA sequence was oriented towards air covering 95% of the substrate.rnSimilar results were obtained with a second type of amphiphile, a DNA block copolymer. Furthermore, the potential to perform molecular recognition experiments at the air/water interface with these DNA hybrid materials was evaluated.rnThird, polyglycerol ester molecules (PGE), which are known to form very stable foams, were studies. Aim was to elucidate the molecular structure of PGE molecules at the air/water interface in order to comprehend the foam stabilization mechanism. Several model systems mimicking the air/water interface of a PGE foam and methods for a noninvasive transfer were tested and characterized by SFM. It could be shown, that PGE stabilizes the air/water interface of a foam bubble by formation of multiple surfactant layers. Additionally, a new transfer technique, the bubble film transfer was established and characterized by high speed camera imaging.The results demonstrate the diversity of structures, which can be formed by amphiphilic molecules at the air/water interface and after film transfer, as well as the impact of the chemical structure on the aggregate morphology.

Die Interaktion von VHL und PTEN bei der Tumorinitiation und Progression

Das VHL-Syndrom umfasst Erkrankungen, die mit einem Funktionsverlust von VHL einhergehen. Das Tumorspektrum umfasst retinale und zerebrale Hämangioblastome, Nierenzysten und klarzellige Nierenkarzinome, Zysten und Tumore des Pankreas, Phäochromocytome, Adenome der Hoden und Tumore des Mittelohrs. Obwohl aufgrund klinischer Studien bekannt ist, welche VHL-Mutation mit welchen Neoplasien assoziiert werden können, konnte bisher kein VHL-Mausmodell das Krankheitsbild des VHL-Syndroms widerspiegeln. Daher ist vermutlich eine zusätzliche Fehlregulation weiterer Gene nötig ist, um die Tumorgenese in den verschiedenen Geweben zu induzieren. In mehreren klarzelligen Nierenkarzinomen konnte bereits eine PTEN-Defizienz nachgewiesen werden, der Verlust von PTEN wird außerdem auch mit der Tumorgenese von Phäochromocytomen assoziiert. Möglicherweise wirken VHL und PTEN also in der Tumorsuppression in der Niere und der Nebenniere zusammen.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals eine VHL-vermittelte Stabilisierung der PTEN-Konzentration sowohl in embryonalen als auch in Tumor-Zellen der Niere nachgewiesen werden. Die Analyse des Regulationsmechanismus ergab erstens eine Hypoxie-abhängige Abnahme der Transkription von PTEN. Des Weiteren konnte eine VHL-vermittelte Ubiquitinylierung von NEDD4-1, welches als E3-Ligase von PTEN dessen Degradation und Kerntransport reguliert, ermittelt werden. rnIn Nierenkarzinom-Zellen wurde weiterhin eine VHL- bzw. PTEN-Restitution induziert, um die Auswirkungen der beiden Tumorsuppressoren auf das Zellverhalten in vitro und in vivo zu untersuchen. Sowohl VHL als auch PTEN hatten dieselben Effekte lediglich in unterschiedlicher Intensität auf das Verhalten der Zellen. So konnte VHL- und PTEN-abhängig eine Verstärkung der Adhäsion, eine Inhibierung der Migration und eine Verminderung der Überlebens- und Metastasierungsfähigkeit nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Mausmodelle mit einem ubiquitären, heterozygoten Pten-Verlust generiert, die teilweise eine zusätzliche Haploinsuffizienz von Vhl bzw. eine heterozygote VHL Typ II-Mutation (V2B oder V2C) trugen. Sporadisch entwickelten diese Mäuse Vhl-abhängig Lebertumore und Pten-abhängig Lymphome und Ovarialkarzinome. Einige Mäuse mit einer kombinierten Vhl- und Pten-Defizienz bildeten zusätzlich Nierenzysten aus, die teilweise das gesamte Volumen der Niere einnahmen. Besonders häufig entstanden in Pten-haploinsuffizienten Mäusen Phäochromocytome, die durch eine zusätzliche V2B- oder V2C-Mutation in gleichaltrigen Mäusen deutlich weiterentwickelt waren. Demnach induziert erst der gemeinsame Verlust von Vhl und Pten die Bildung von Nierenzysten und Phäochromocytomen, welche dem Krankheitsbild des VHL-Syndroms zugeordnet werden.rnDie Untersuchungen innerhalb dieser Arbeit zeigen erstmalig die Interaktion und Kooperation von VHL und PTEN in der Tumorsuppression. Die Resultate bieten außerdem die Grundlage für weitere Analysen der Auswirkung der VHL-vermittelten PTEN-Stabilisierung und für detailliertere Untersuchungen der durch die kombinierte Vhl- und Pten-Defizienz induzierten Neoplasien der Niere und der Nebennieren-Tumore in in vivo Mausmodellen.rn

Regulation von "Silent mating type information regulation 2 homolog Type" 1 (SIRT1) durch die nach DNA-Schaden induzierte Kinase "Homeodomain-interaction kinase" (HIPK2)

"Silent mating type information regulation 2 Type" 1 (SIRT1), das humane Homolog der NAD+-abhängigen Histondeacetylase Sir2 aus Hefe, besitzt Schlüsselfunktionen in der Regulation des Metabolismus, der Zellalterung und Apoptose. Letztere wird vor allem durch die Deacetylierung von p53 an Lys382 und der dadurch verringerten Transkription proapoptotischer Zielgene vermittelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die SIRT1 Regulation im Zusammenhang mit der DNA-Schadensantwort untersucht.rnIn der Apoptoseregulation übernimmt die Serin/Threonin-Kinase "Homeodomain interacting protein kinase" 2 (HIPK2) eine zentrale Rolle und daher wurde die SIRT1 Modifikation und Regulation durch HIPK2 betrachtet. Durch Phosphorylierung des Tumorsuppressorproteins p53 an Ser46 aktiviert HIPK2 das Zielprotein und induziert die Transkription proapoptotischer Zielgene von p53. Es wurde beschrieben, dass HIPK2 nach DNA-Schädigung über einen bisher unbekannten Mechnismus die Acetylierung von p53 potenzieren kann.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass SIRT1 von HIPK2 in vitro und in Zellen an Serin 27 und 682 phosphoryliert wird. Weiterhin ist die Interaktion von SIRT1 mit HIPK2 sowie die SIRT1 Phosphorylierung an Serin 682 durch DNA-schädigende Adriamycinbehandlung erhöht. Es gibt Hinweise, dass HIPK2 die Expression von SIRT1 reguliert, da HIPK2 RNA-Interferenz zur Erniedrigung der SIRT1 Protein- und mRNA-Mengen führt.rnEin weiterer interessanter Aspekt liegt in der Beobachtung, dass Ko-Expression von PML-IV, welches SIRT1 sowie HIPK2 in PML-Kernkörper rekrutiert, die SIRT1 Phosphorylierung an Serin 682 verstärkt. Phosphorylierung von SIRT1 an Serin 682 interferiert wiederum mit der SUMO-1 Modifikation, welche für die Lokalisation in PML-Kernkörpen wichtig ist.rnBemerkenswerterweise reduziert die DNA-schadendsinduzierte SIRT1 Phosphorylierung die Bindung des SIRT1 Ko-Aktivators AROS, beeinflusst aber nicht diejenige des Inhibitors DBC1. Dies führt zur Reduktion der enzymatischen Aktivität von SIRT1 und der darausfolgenden weniger effizienten Deacetylierung des Zielproteins p53.rnDurch die von mir in der vorliegenden Promotionsarbeit erzielten Ergebnisse konnte ein neuer molekularer Mechanismus entschlüsselt werden, welcher die durch HIPK2 modulierte Acetylierung von p53 und die daran anschließende Induktion der Apoptose beschreibt.rnHIPK2-vermittelte SIRT1 Phosphorylierung resultiert in einer verminderten Deacetylasefunktion von SIRT1 und führt so zu einer verstärkten acetylierungsinduzierten Expression proapoptotischer p53 Zielgene.