Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells

RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat großes Potential für den Einsatz in der Therapie. Obwohl effiziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die großen Hürden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integritätsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3’- bzw. -5’-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verhältnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassifizierung des Integritätslevels einer siRNA Probe (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der Küvette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung für in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und ermöglichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares für die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschließende Evaluierung der RNase-Protektion ergab für Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse können diese und andere Transportsysteme nun für eine zelluläre Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften für Echtzeit-Integritätsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler “Cross-Talk” ermöglichten es, transfizierte Zellen über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anfängliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate für den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum für diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und Änderungen in der zellulären Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrität zurück.rn

Untersuchungen zur Rolle des BH3-only-Proteins Bid bei der Stress-induzierten Apoptose in Karzinomzelllinien

Als BH3-only Protein gehört Bid zu den proapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie, die während der Apoptose die Freisetzung Caspase-aktivierender Proteine aus den Mitochondrien kontrollieren. Bid zählt zu den potentesten BH3-only Proteinen und wird von vielen transformierten und nichttransformierten Zellen konstitutiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, Bid durch RNA-Interferenz stabil zu depletieren, um Bid-abhängige Apoptosewege in HeLa Zervixkarzinomzellen zu identifizieren, die von intrinsischen Stressstimuli sowie von konventionellen und neuartigen Chemotherapeutika induziert werden. Da Bid im Todesrezeptor-vermittelten Signalweg der Apoptose durch Caspase-8 gespalten und aktiviert wird, waren die Bid-depletierten Zellen signifikant vor der Fas/CD95-, TRAIL- oder TNF-α-induzierten Apoptose geschützt und zeigten nach Exposition mit allen drei Todesrezeptorliganden eine drastisch reduzierte Effektorcaspase-Aktivität und eine höhere Proliferationsrate als die Kontrollzellen. Eine ektopische Bidexpression in Bid knock down (kd) Zellen hob die Protektion vor der Fas- und TRAIL-induzierten Apoptose auf. Der Proteasominhibitor Epoxomicin, der Proteinkinase-Inhibitor Staurosporin oder die ER Stress-induzierenden Agenzien Tunicamycin, Thapsigargin und Brefeldin A lösten hingegen einen Bid-unabhängigen Zelltod aus. Allerdings konnten subletale Tunicamycin- oder Thapsigarginkonzentrationen HeLa Zellen für die TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren. Da der Synergieeffekt auf einer ER Stress-vermittelten Amplifizierung des Todesrezeptorwegs beruhte, zu der eine Tunicamycin-induzierte Steigerung der Expression des Todesrezeptors DR5 signifikant beitrug, erfolgte diese Sensitivierung nur in Bid-profizienten Zellen. Bid war in HeLa Zellen außerdem an der apoptotischen Signalkaskade beteiligt, die von den DNA-schädigenden Agenzien Etoposid, Doxorubicin und Oxaliplatin (Oxa) ausgelöst wird. Nach Behandlung mit Oxa zeigten die Bid kd Zellen eine verzögerte Caspase-2, -3, -8 und -9 Aktivierung, einen geringeren Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie eine reduzierte Apoptose- und eine höhere Proliferationsrate als Bid-profiziente Zellen. Neben Bid war ein weiteres BH3-only Protein, Puma, an der Oxa-induzierten Effektorcaspase-Aktivierung beteiligt, da eine Puma-spezifische siRNA unabhängig vom Bidstatus der Zellen antiapoptotisch wirkte. Im letzten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche Proteasen für die durch gentoxische Agenzien induzierte Spaltung und Aktivierung von Bid verantwortlich sind. Obwohl Caspasen für die Exekutionphase der Oxa-induzierten Apoptose notwendig waren, trugen sie weder zur initialen Bidaktivierung noch zur mitochondrialen Depolarisierung bei, da sie erst postmitochondrial aktiviert wurden. Konventionelle Calpaine hingegen wurden nach DNA-Schädigung bereits stromaufwärts der Mitochondrien aktiviert und der Calpaininhibitor Calpeptin reduzierte nicht nur die Bid- und Caspasespaltung, sondern auch die mitochondriale Depolarisierung signifikant. Diese Protektion durch Calpeptin fiel in Bid-depletierten Zellen signifikant geringer als in Bid-profizienten Kontrollzellen aus. Auch war in Oxa-behandelten Bid kd Zellen, die eine durch Caspase-2, -3 und -8 nicht spaltbare Bidmutante exprimierten, trunkiertes Bid nachweisbar, dessen Generierung durch Calpain-, aber nicht durch Caspaseinhibierung verhindert werden konnte. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine Calpain-abhängige Bidaktivierung stromaufwärts der Mitochondrien hin und zeigen, dass die BH3-only Proteine Bid und Puma wichtige Vermittler der Oxa-induzierten Apoptose in HeLa Zellen darstellen.

Evaluation of a viral vector system, based on a defective interfering RNA of tomato bushy stunt virus, for protein expression and the induction of gene silencing

A viral vector system was developed based on a DI-RNA, a sub-viral particle derived from TBSV-BS3-statice. This newly designed vector system was tested for its applicability in protein expression and induction of gene silencing. Two strategies were pursued. The first strategy was replication of the DI-RNA by a transgenically expressed TBSV replicase and the second was the replication by a so called helper virus. It could be demonstrated by northern blot analysis that the replicase, expressed by the transgenic N. benthamiana plant line TR4 or supplied by the helper virus, is able to replicate DI-RNA introduced into the plant cells. Various genes were inserted into different DI constructs in order to study the vector system with regard to protein expression. However, independent of how the replicase was provided no detectable amounts of protein were produced in the plants. Possible reasons for this failure are identified: the lack of systemic movement of the DI-RNA in the transgenic TR4 plants and the occurrence of deletions in the inserted genes in both systems. As a consequence the two strategies were considered unsuitable for protein expression. The DI-RNA vector system was able to induce silencing of transgenes as well as endogenous genes. Several different p19 deficient helper virus constructs were made to evaluate their silencing efficiency in combination with our DI-RNA constructs. However, it was found that our vector system can not compete with other existing VIGS (virus induced gene silencing) systems in this field. Finally, the influence of DI sequences on mRNA stability on transient GUS expression experiments in GUS silenced plants was evaluated. The GUS reporter gene system was found to be unsuitable for distinguishing between expression levels of wild type plants and GUS silenced transgenic plants. The results indicate a positive effect of the DI sequences on the level of protein expression and therefore further research into this area is recommended.

Functionalization and detection of RNA and its modifications

Unterschiedlich substituierte Reagenzien, basierend auf dem Cumarin Körper, wurden untersucht und Struktur-Funktions-Beziehungsstudien zeigten eine Selektivität für ein natürlich vorkommendes, modifiziertes Nukleosid, 4-Thiouridine (s4U). Im Verlauf dieser Experimente, fiel ein multifunktionales Cumarin, namens PBC, aus mehreren Gründen auf. Neben seiner 2000 fachen Selektivität für s4U gegenüber Uridin, besitzt PBC ein zusätzliches terminales Alkin für Konjugationsreaktionen mit Aziden. Es wurde zusätzlich zur Fluoreszenzmarkierung von small interfering RNA benutzt, deren Fluoreszenz in Zellen beobachtet werden konnte. Mit PBC kommt ein neues chemisches Reagenz zur Detektion von modifizierten Nukleosiden zum bereits vorhandenen Repertoire hinzu.rnDiese Arbeit zeigt zusätzlich eine neue Labelingstrategie, basierend auf einem kleinen, multifunktionalen chemischen Reagenz, welches spezifisch mit Uridinen in RNA reagiert. Dieses Cumarin-basierte Reagenz, namens N3BC, hat den Vorteil (I) post-transkriptionell gegenüber allen möglichen RNAs einsetzbar zu sein, (II) Fluoreszenz zu zeigen und (III) eine weitere funktionelle Gruppe zu besitzen, die in Biokonjugationsreaktionen einsetzbar ist. Die letzteren umfassen z.B. die durch UV ausgelösten crosslinking Experimente mit verwandten Proteinen, sowie die bioorthognale CuAAC Reaktion mit fluoreszenten Alkin-Farbstoffen.rnFür verlässliche Detektion wurden mehrere LC-MS/MS Methoden, zur Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 21 Ribonukleosiden und 5 Deoxyribonukleosiden in einem Einzellauf, entwickelt. Zusätzlich wurden diese Methoden in mehreren Studien, hauptsächlich von Methyltransferasen, angewandt. rn

Spezifische Inhibition des Wnt-Signalwegs und die Analyse der Konsequenzen auf zellbiologischer Ebene

Der kanonische Wnt Signalweg ist durch Regulation einer Vielzahl von Zielgenen in unterschiedliche Prozesse wie Entwicklung, Wachstum und Differenzierung involviert. Fehlregulation des Signalwegs kann zur Tumorentstehung führen. Die exakte Rolle des Wnt Signalwegs und seiner Zielgene in der karzinogenen Kaskade ist noch nicht genau bekannt. In dieser Arbeit sollte die Beteiligung der Wnt Zielgene c-MYC, CCND1 (kodiert Cyclin D1) und VEGF an der Karzinogenese untersucht werden. Um die Funktionen der Wnt Zielgene und ihre zellulären Effekte unabhängig voneinander untersuchen zu können, wurden die Mengen der entsprechenden Transkriptionsprodukte durch siRNA (short interfering RNA) gezielt verringert. Die Konsequenzen der Inaktivierung wurden in Kolon- und Zervixkarzinomzelllinien untersucht, wobei die zellulären Parameter Proliferation, Apoptose, Metabolismus sowie Migration und Adhäsion untersucht wurden. Dabei konnte beobachtet werden, dass der Wnt Signalweg mit seinen Zielgenen Cyclin D1 und c-MYC die Proliferation mit dem Energiemetabolismus von Tumorzellen verknüpft. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Cyclin D1 an der Regulation der zelluläre Migration und Adhäsion beteiligt ist, während VEGF die Apoptose abhängig vom zellulären Kontext inhibiert. Diese Ergebnisse liefern erste Hinweise auf die funktionelle Rolle der verschiedenen Zielgene im Prozess der Karzinogenese in Tumoren mit aktiviertem Wnt Signalweg. Damit ist diese Arbeit ein möglicher Ausgangspunkt für Studien mit dem Ziel der gezielten therapeutischen Beeinflussung des Wnt Signalwegs auf Ebene der Zielgene.

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.

Optimization of RNA-based transgene expression by targeting Protein Kinase R

The aim of this thesis was to establish a method for repeated transfection of in vitro transcribed RNA (IVT-RNA) leading to a sustained protein expression lasting for days or even weeks. Once transfected cells recognize IVT-RNA as "non-self" and initiate defense pathways leading to an upregulated interferon (IFN) response and stalled translation. In this work Protein Kinase R (PKR) was identified as the main effector molecule mediating this cellular response. We assessed four strategies to inhibit PKR and the IFN response: A small molecule PKR inhibitor enhanced protein expression and hampered the induction of IFN-transcripts, but had to be excluded due to cytotoxicity. A siRNA mediated PKR knockdown and the overexpression of a kinase inactive PKR mutant elevated the protein expression, but the down-regulation of the IFN response was insufficient. The co-transfer of the viral inhibitors of PKR and the IFN response was most successful. The use of E3, K3 and B18R co-transfection enabled repeated IVT-RNA-based transfection of human fibroblasts. Thus, the developed protocol allows a continuous IVT-RNA encoded protein expression of proteins, which could be the basis for the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) for several therapeutic applications in regenerative medicine or drug research.

A single chain antibody against a viral RNA polymerase (TBSV-BS3-Statice)

Expression of antibodies in plant against essential viral proteins could provide an alternative approach to engineered viral resistance. Engineered single chain Fv antibodies scFV are particularly suitable for expression in plant because of their small size and the lack of assembly requirements. RNA-dependent RNA polymerases (RdRps) function as the catalytic subunit of viral replicases required for the replication of all positive strand RNA viruses. By using Phage technology we selected scFvs from a phage library using purified E.coli expressed TBSV(Tomato bushy stunt virus) replicase as antigen. The scFvs mediated-inhibition of RdRp activity was studied in vitro and in planta. In vitro experiments showed the inhibition of CNV(Cucumber necrosis virus) and TCV(Turnip crinkle virus) RdRp. Transient in planta assays based on agroinfiltration and an infectious clone of TBSV demonstrated the inhibition of the replication of TBSV(Tomato bushy stunt virus). Epitope mapping showed that the selected scFvs target the motif E of RdRp which is involved in template binding.Moreover T1 plants of transgenic lines of N. benthamiana expressing different scFvs either in the cytoplasm or the ER (endoplasmic reticulum) showed a high level of resistance against infection with TBSV and RCNMV(Red clover necrotic mosaic virus) upon inoculation with virus particles. This is the first report that scFvs against a RdRp of a plant viruses can inhibit viral replication in vivo. The resistance is even efficient against viruses belonging to different virus families.

Tetracycline-inducible RNAi Knockdown of SCL (Stem Cell Leukaemia) in Mice

RNAi (RNA interference) is a powerful technology for sequence-specific targeting of mRNAs. This thesis was aimed at establishing conditions for conditional RNAi-mediated silencing first in vitro and subsequently also in transgenic mice. As a target the basic helix-loop-helix transcription factor encoding gene SCL (stem cell leukaemia also known as Tal-1 or TCL5) was used. SCL is a key regulator for haematopoietic development and ectopic expression of SCL is correlated with acute T-lymphoblastic leukaemias. Loss of SCL function studies demonstrated that ab initio deletion of SCL resulted in embryonic lethality around day E9 in gestation. To be able to conditionally inactivate SCL, RNAi technology was combined with the tetracycline-dependent regulatory system. This strategy allowed to exogenously control the induction of RNAi in a reversible fashion and consequently the generation of a completely switchable RNAi knockdown. First a suitable vector allowing for co-expression of tetracycline-controlled shRNAs (small hairpin RNAs) and constitutively active EGFP (enhanced green fluorescent protein) was generated. This novel vector, pRNAi-EGFP, was then evaluated for EGFP expression and tetracycline-mediated expression of shRNAs. Four sequences targeting different regions within the SCL mRNA were tested for their efficiency to specifically knockdown SCL. These experiments were performed in M1 murine leukaemia cells and subsequently in the HEK 293 cell line, expressing an engineered HA-tagged SCL protein. The second assay provided a solid experimental method for determining the efficiency of different SCL-siRNA knockdown constructs in tissue culture. Western blotting analyses revealed a down regulation of SCL protein for all four tested SCL-specific target sequences albeit with different knockdown efficiencies (between 25% and 100%). Furthermore, stringent tetracycline-dependent switchability of shRNA expression was confirmed by co-transfecting the SCL-specific pRNAi-EGFP vector (SCL-siRNA) together with the HA-tagged SCL expression plasmid into the HEK 293TR /T-REx cell line constitutively expressing the tetracycline repressor (TetR). These series of experiments demonstrated tight regulation of siRNA expression without background activity. To be able to control the SCL knockdown in vivo and especially to circumvent any possible embryonic lethality a transgenic mouse line with general expression of a tetracycline repressor was needed. Two alternative methods were used to generate TetR mice. The first approach was to co-inject the tetracycline-regulated RNAi vector together with a commercially available and here specifically modified T-REx expression vector (SCL-siRNA T-REx FRT LoxP mouse line). The second method involved the generation of a TetR expressor mouse line, which was then used for donating TetR-positive oocytes for pronuclear injection of the RNAi vector (SCL-siRNA T-REx mouse line). As expected, and in agreement with data from conditional Cre-controlled adult SCL knockout mice, post-transcriptional silencing of SCL by RNAi caused a shift in the maturation of red blood cell populations. This was shown in the bone marrow and peripheral blood by FACS analysis with the red blood cell-specific TER119 and CD71 markers which can be used to define erythrocyte differentiation (Lodish plot technique). In conclusion this study established conditions for effective SCL RNAi-mediated silencing in vitro and in vivo providing an important tool for further investigations into the role of SCL and, more generally, of its in vivo function in haematopoiesis and leukaemia. Most importantly, the here acquired knowledge will now allow the establishment of other completely conditional and reversible knockdown phenotypes in mice.

Investigations into the effect of nucleoside modifications on the physicochemical properties and biological function of DNA and RNA

This thesis explores the effect of chemical nucleoside modification on the physicochemical and biological properties of nucleic acids. Positional alteration on the Watson-Crick edge of purines and pyrimidines, the “C-H” edge of pyrimidines, as well as both the Hoogsteen and sugar edges of purines were attempted by means of copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition. For this purpose, nucleic acid building blocks carrying terminal alkynes were synthesized and introduced into oligonucleotides by solid-phase oligonucleotide chemistry. rnOf particular interest was the effect of nucleoside modification on hydrogen bond formation with complementary nucleosides. The attachment of propargyl functionalities onto the N2 of guanosine and the N4 of 5-methylcytosine, respectively, followed by incorporation of the modified analogs into oligonucleotides, was successfully achieved. Temperature dependent UV-absorption melting measurements with duplexes formed between modified oligonucleotides and a variety of complementary strands resulted in melting temperatures for the respective duplexes. As a result, the effect that both the nature and the site of nucleoside modification have on base pairing properties could thus be assisted. rnTo further explore the enzymatic recognition of chemically modified nucleosides, the oligonucleotide containing the N2-modified guanosine derivative on the 5’-end, which was clicked to a fluorescent dye, was subjected to knockdown analyses of the eGFP reporter gene in the presence of increasing concentrations of siRNA duplexes. From these dose-dependent experiments, a clear effect of 5’-labeling on the knockdown efficiency could be seen. In contrast, 3’-labeling was found to be relatively insignificant.rn

Rolle der FOS-Proteine und des MAPK-Signallings in der Regulation der zellulären Antwort auf genotoxischen Stress

Die mittlere Überlebenszeit nach Erkennung eines Glioblastoms ohne Behandlung liegt bei 3 Monaten und kann durch die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) auf etwa 15 Monate gesteigert werden. Neben TMZ sind die chlorethylierenden Nitrosoharnstoffe die meistversprechendsten und am häufigsten eingesetzten Chemotherapeutika in der Gliomtherapie. Hier liegt die mittlere Überlebenszeit bei 17,3 Monaten. Um die Therapie des Glioblastoms noch effektiver zu gestalten und Resistenzen zu begegnen, werden unterschiedlichste Ansätze untersucht. Eine zentrale Rolle spielen hierbei das activator protein 1 (AP-1) und die mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK), deren Funktion in bisherigen Arbeiten noch unzureichend beleuchtet wurde.rnBesonders mit der Rolle des AP-1-bildenden Proteins FRA-1 in der Therapie des Glioblastoms haben sich bisher nur wenige Arbeiten beschäftigt, weshalb im ersten Teil der vorliegenden Arbeit dessen Funktion in der Regulation der Chemosensitivität gegenüber dem chlorethylierenden Agenz ACNU genauer untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die FRA 1-Expression durch Behandlung mit ACNU induziert wird. Die Induktion erfolgte über die beiden MAPKs ERK1/2 und p38K. JNK hatte keinen Einfluss auf die Induktion. Durch die Herunterregulation der FRA-1-Expression mit Hilfe von siRNA und eines shRNA exprimierenden Plasmids kam es zu einer signifikanten Sensitivierung gegenüber ACNU. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulation der FRA-1-Expression in einer verminderten AP 1-Bildung, bedingt durch eine reduzierte Menge an FRA-1 im AP-1-Komplex resultiert. Die Sensitivierung gegenüber ACNU ist weder durch eine Veränderung in der DNA-Reparatur, noch in der Modulation der FAS-Ligand- bzw. FAS-Rezeptor-Expression bedingt. Auch die hier untersuchten BCL 2-Familienmitglieder wiesen keine Unterschiede in der Expression durch Modulation der FRA 1-Expression auf. Allerdings kam es durch die verminderte FRA-1-Expression zu einer Reduktion der Zellzahl in der G2/M-Phase nach Behandlung mit ACNU. Diese ging einher mit einer reduzierten Menge an phosphoryliertem und unphosphoryliertem CHK1, weshalb davon auszugehen ist, dass FRA 1 nach ACNU-Behandlung in Gliomzellen vor der Apoptose schützt, indem es modulierend auf die Zellzykluskontrolle einwirkt.rnIm zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation der apoptotischen Antwort nach Behandlung mit ACNU und TMZ genauer beleuchtet, wobei ein spezielles Augen¬merk auf AP 1 und die MAPKs gelegt wurde. Hier konnte gezeigt werden, dass die Apoptose nach Behandlung mit ACNU bzw. TMZ sowohl durch Spaltung von Pro-Caspase 8, als auch Pro-Caspase 9 eingeleitet wird. Dabei akkumulierte in beiden Fällen p53 vermehrt im Zellkern. Eine Inhibierung der transkriptionellen Aktivität von p53 führte nach ACNU-Behandlung zu einer Sensitivierung der Zellen, nach TMZ-Behandlung kam es zu einem leichten Anstieg in der Vitälität. Der FAS-Rezeptor wurde nach ACNU- und nach TMZ-Behandlung aktiviert und auch die DNA-Reparaturproteine DDB2 und XPC wurden in beiden Fällen vermehrt exprimiert. Für die MAPKs JNK und ERK1/2 konnte gezeigt werden, dass diese pro-apoptotisch wirken. Die AP-1-Bildung nach ACNU-Behandlung erfolgte bereits nach 24 h und war von langer Dauer, wohingegen nach TMZ-Behandlung nur eine transiente AP 1-Bildung zu relativ späten Zeitpunkten detektiert werden konnte. Ebenso konnte für das AP-1-Zielgen FAS-Ligand nach ACNU-Behandlung eine relativ schnelle, lang anhaltende Aktivierung detektiert werden, wohingegen nach TMZ-Behandlung zu einem späten Zeitpunkt ein kurzer Anstieg im Signal zu verzeichnen war. In späteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass das BCL-2-Familienmitglied BIM eine zentrale Rolle in der Regulation des intrinsischen Apoptosesignalweges nach Behandlung mit ACNU und TMZ spielt. Die hier entstanden Ergebnisse tragen entscheidend zum Verständnis der durch diese beiden Agenzien gesteuerten, apoptotischen Signalwege bei und bieten eine fundierte Grundlage für weitere Untersuchungen.rn

Evaluation of polymeric nanocarriers for RNA delivery

Therapeutic RNAs, especially siRNAs, are a promising approach for treating diseases like cancer, neurodegenerative disorders and viral infections. Their application, however, is limited due to a lack of safe and efficient delivery systems. Nanosized carriers with the ability to either complex or entrap RNA species are a promising option. rn rn rnSuch a carrier has to meet a lot of requirements, some of which are even partly contradictive. Understanding and controlling the interplay between the different demands would advance a strategic design at an early stage of therapeutic development. rn rn This work is centered around a systematic evaluation of polyplexes, such carriers that are able to complex siRNA due to electrostatic interactions. Six structurally and chemically diverse candidates, poly-L-lysine brushes, block copolymers, cationic peptides, cationic lipids, nanohydrogels, and manganese oxide particles, were tested in a simultaneous fashion. The assays, mostly based on fluorescently labeled siRNA, ranged from the evaluation of polyplex formation and stability to in vitro parameters like cellular uptake and knockdown capability. The analysis from several perspectives offered insight into the interplay between the specifications of one polyplex. Assessing the different carriers under exactly the same experimental conditions also allowed conclusions about favourable traits and starting points for further optimization. This comparative approach also revealed weaknesses of some of the conventional protocols, which were therefore contrasted with alternative methods. In addition, in vitro knockdown assays were optimized and the impact of fluorescently labeled siRNA on knockdown efficiency was assessed. rn rn rn A second class of carriers, which share the ability to entrap siRNA inside their matrix, are briefly addressed. Nanocapsules, dextran particles and liposomes were assessed for basic features like siRNA encapsulation and knockdown capability. rn rn rn rn In an approach towards targeted delivery of RNA, liposomes were endowed with mitochondriotropic tags. Despite successful functionalization, no colocalization between the liposomal cargo and mitochondria was so far observed, which makes further optimization necessary.

First contact imaging of nanoparticular siRNA – From synthesis to application of a prodye concept

Delivery of therapeutic nucleic acid based drugs is still very demanding and difficult to manage and monitor. For this reason, a precise method for the monitoring of RNAi pathways is necessary. This thesis explores a new approach for sensing of potentially therapeutic nucleic acids, using the interaction of so called prodyes with intracellular enzymes in a prodrug manner. To realize this concept, some non-fluorescent, fluorescein based asymmetric dyes were synthesized and their spectroscopic characteristics were studied. Azide-alkyne Click chemistry was applied for conjugation purposes, using a new protocol at weak acidic pH to get intact prodye constructs. Both, an electrophoretic mobility shift assay with polyacrylamide gels and in-cuvette experiments showed remarkable OFF-to-ON behavior of these new siRNA constructs under physiological conditions. After salt-free purification, subsequent hybridization to double-stranded ribonucleic acids and nanoformulation to lipoplexes, the prodye conjugated siRNA was examined in cellular uptake studies for First Contact Imaging. The investigated siRNA-prodye conjugates showed strong sensitivity to esterases, being hydrolyzed at the biolabile function and developing a strong fluorescence which was verified in bulk. As an optimization, a new profluorescent molecule system was designed and synthesized, which has a carbonate as biolabile 6’ protecting group and a highly water soluble 3’ clickable linker. This new non-fluorescent but colored prodye showed 12 - 320 times increased fluorescence intensities between OFF- and ON- states, depending to the deprotection method. This is the first reported molecule model of an asymmetric profluorescent fluorescein, having the very favorable 3’ & 6’ functions.