Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese

Konditionale Modellsysteme zur Untersuchung der ERBB2-induzierten Tumorgenese Die Rezeptor-Tyrosinkinase ERBB2 ist in einer Vielzahl epithelialer Tumore, wie Mamma- und Ovarialkarzinomen, überexprimiert. Diese erhöhte Expression korreliert mit aggressivem Tumorwachstum, verstärkter Metastasierung und schlechter Prognose für den Patienten. Zur genaueren Untersuchung molekularer Mechanismen, die zur Tumorentstehung infolge der ERBB2-Überexpression führen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Tet-Systems induzierbare MCF-7 Zelllinien generiert. Diese exprimieren bei Gabe von Doxyzyklin ERBB2 bzw. die zum humanen ERBB2 homologe und durch Punktmutation onkogen aktivierte Rattenvariante NeuT. Nachdem die stringente Regulierbarkeit durch Doxyzyklin für die untersuchten Zellklone gezeigt werden konnte, stellte sich bei der Charakterisierung der Zelllinien heraus, dass die Induktion von ERBB2 erstaunlicherweise nicht zur Proliferation der Zellen, sondern zum Wachstumsarrest führt. Bei der Untersuchung verschiedener Zellzyklusregulatoren konnte dieser Zellzyklusarrest dem CDK-Inhibitor P21 zugeordnet werden, dessen Expression durch ERBB2 induziert wird. In P21-Antisense-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass P21 eine Schlüsselrolle beim ERBB2-induzierten Zellzyklusarrest spielt. Neben der Induktion von P21 und der daraus resultierenden Wachstumsinhibition zeigten die Zellen starke morphologische Veränderungen und waren positiv beim Nachweis der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase. Erstmals konnte gezeigt werden, dass die Induktion des Onkogens ERBB2 nicht zur Proliferation, sondern zur Aktivierung eines verfrühten Seneszenz-Programms führt, welches der Zelle Schutz gegen die Onkogeneinwirkung bietet. Bei der Untersuchung verschiedener Signaltransduktionskaskaden mit Inhibitormolekülen konnte die Aktivierung dieses Seneszenz-Programms der Stress-aktivierten Proteinkinase P38 zugeordnet werden. Zur Identifizierung von Genen, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sind, wurde die differenzielle Genexpression eines NeuT-Klons nach 8- bzw. 48-stündiger Induktion mit Doxyzyklin in einem cDNA-Array untersucht. Dabei zeigte sich eine besonders starke Induktion von Integrin 5 und Integrin 1, die zusammen den Fibronektinrezeptor bilden. Der funktionale Nachweis des Rezeptors in einem Adhäsionsassay demonstrierte ein stark erhöhtes Adhäsionsverhalten ERBB2-überexprimierender Zellen an Fibronektin. Bei der Untersuchung von Mamma-, Ovarial- und Endometriumkarzinomen konnte die Expression von ERBB2 mit der von Integrin 5 korreliert werden. Diese Ergebnisse machen Integrin 5 zu einem potenziellen neuen Tumormarker und Therapieziel in ERBB2-überexprimierenden Tumoren. Ein weiteres interessantes Gen, das sich im Array durch ERBB2 überexprimiert zeigte, war die Matrix-Metalloproteinase MMP-9. In einem Zymografieassay konnte die erhöhte Gelatinaseaktivität von MMP-9 in Dox-induzierten Zellen nachgewiesen werden. Der Einsatz verschiedener Signaltransduktionsinhibitoren ergab, dass auch die ERBB2-induzierte Expression von MMP-9 über die Aktivierung von P38 läuft. Bei der Suche nach weiteren MMPs, die für die ERBB2-induzierte Tumorgenese relevant sein könnten, wurde MMP-13 untersucht. Erstmals konnte gezeigt werden, dass diese Matrix-Metalloproteinase von ERBB2 induziert wird. Dieser interessante Befund wurde auch in einem anderen Zellmodell in NIH3T3 Mausfibroblasten verifiziert. Durch ihre Matrix-degradierenden Eigenschaften sind MMPs potente „Werkzeuge“ für Tumorzellen und stellen ein wichtiges Ziel zur Unterbindung der Invasion und Metastasierung dieser Zellen dar. Neben den Zellkulturarbeiten wurden im Rahmen dieser Dissertation transgene Responder-Mäuse generiert, die NeuT unter Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors exprimieren. Von vier transgenen Gründerlinien zeigten zwei eine unerwünschte, basale NeuT-Expression, für die beiden anderen Linien konnte sowohl in MEF-Assays, als auch nach Kreuzung mit rtTA- bzw. tTA-Effektor-Mäusen eine Dox-abhängige Regulation des Transgens gezeigt werden. Die Tiere dieser Linien sollen in Zukunft mit Effektor-Mäusen gepaart werden, die den rtTA bzw. tTA spezifisch in für die ERBB2-Tumorgenese relevanten Geweben, wie Ovarial- oder Lungenepithelzellen, exprimieren. So können individuelle Tumormodelle für die verschiedenen epithelialen Tumore, bei denen die Überexpression von ERBB2 von Bedeutung ist, entwickelt und untersucht werden.

Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen der Ratte

Die freien Endigungen von Spinalganglienneuronen sind für die Detektion schmerzhafter Reize verantwortlich. Dabei rufen thermische, chemische oder mechanische Reize Ionenströme über die Membran und dadurch Membranpotentialänderungen hervor. Diese noxisch induzierten Ströme sind in großem Ausmaß durch chemische Substanzen und andere Reize modulierbar. Der Ionenkanal TRPV1 ist für die Detektion zahlreicher chemischer Reize und zumindest eines Teils der noxischen Hitzereize verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der Mechanismen geklärt, die zur schnellen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme führen. Hierfür wurden akut dissoziierte Spinalganglienneurone der Ratte als Modell ihrer peripheren Endigung verwendet und mittels Ganzzellableitung in der patch-clamp-Technik untersucht. Die Verwendung von Trypsin während der Präparation von Spinalganglienneuronen hat keinen funktionellen Einfluss auf hitze- oder capsaicininduzierte Ströme, verbessert aber die Untersuchungsbedingungen für das patch-clamp-Verfahren. Bei 144 akut dissoziierten Spinalganglienneuronen wurden die Stromantworten auf drei im Abstand von 40 s durch Überspülen mit 45,3 bis 46,3°C heißer Extrazellularlösung applizierte einsekündige Hitzereize gemessen. Dabei ließen sich repetitiv reproduzierbare hitzeinduzierte Einwärtsströme von etwa 160 pA erzielen; es konnte keine Tachyphylaxie und nahezu keine Inaktivierung beobachtet werden. Direkt vor dem zweiten Hitzereiz wurden die Neurone für zwei Sekunden mit Extrazellularlösung überspült, die Kontrolllösung, 0,5 μM Capsaicin, 10 μM Natriumnitroprussid oder 10 μM YC-1 enthielt. Es fand sich kein Hinweis, dass Stickstoffmonoxid oder die Guanylatzyklase einen signifikanten Beitrag zur Sensibilisierung von hitzeinduzierten Strömen in Spinalganglienneuronen leisten, wobei ein durch den Versuchsaufbau bedingtes Auswaschen zytosolischer Faktoren, die für den Signalweg notwendig sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Bei einer Konzentration von 0,5 μM löst Capsaicin für zwei Sekunden einen sehr kleinen Einwärtsstrom von etwa 33 pA aus und führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung von hitzeinduzierten Einwärtsströmen in Spinalganglienneuronen (p<0,01). Das Ausmaß der Sensibilisierung ist proportional zur Größe des capsaicininduzierten Stromes (r=−0,7, p<0,001). Konstant halten der intrazellulären Calciumkonzentration mittels des Calciumchelators BAPTA verhindert die capsaicininduzierte Sensibilisierung hitzeinduzierter Ströme an Spinalganglienneuronen. Demzufolge beruht die capsaicininduzierte Sensibilisierung trotz der schnellen Kinetik nicht auf einer synergistischen Wirkung der beiden Agonisten Capsaicin und Hitze auf ihren gemeinsamen Rezeptor; vielmehr ist sie von einer Erhöhung der intrazellulären freien Calciumkonzentration abhängig. Funktionelle Änderungen der zellulären Funktion werden häufig durch Proteinkinasen vermittelt. Die zur Gruppe der MAP-Kinasen gehörende ERK (extracellular signal related kinase) wird bei Membrandepolarisation und Calciumeinstrom in die Zelle durch MEK (MAPK/extracellular signal related kinase kinase) aktiviert. Blockade der MEK/ERK-Kaskade durch den spezifischen MEK-Hemmstoff U0126 führt ebenfalls zu einer Aufhebung der Sensibilisierung der Hitzeantworten durch Capsaicin. Applikation von Capsaicin führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen. Diese Sensibilisierung wird durch einen Calciumeinstrom in die Zelle und die dadurch eintretende Aktivierung von Proteinkinasen hervorgerufen. Die MEK/ERK-Kaskade ist ein sehr schnell (deutlich unter 2 s) aktivierbares intrazelluläres Signalsystem, welches bei der Regulation der Empfindlichkeit nozizeptiver Spinalganglienneurone eine entscheidende Rolle spielt; die schnelle Kinetik ist dabei nur durch eine membranständige oder zumindest membrannahe Lokalisation dieser Proteinkinasen erklärbar. Durch Applikation zehnsekündiger Hitzereize lässt sich ebenfalls eine Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme auslösen, die ebenso ausgeprägt ist, wie die Sensibilisierung durch 0,5 μM Capsaicin (p<0,005). Durch das immer größere Verständnis der Funktionsweise des nozizeptiven Systems ergeben sich ständig neue Ansätze für die Entwicklung neuer Analgetika. So könnte durch Modulation spezifischer intrazellulärer Proteinkinasen der Phosphorylierungszustand und damit die Aktivierbarkeit von Ionenkanälen, die der Transduktion noxischer Reize dienen, positiv beeinflusst werden. Neuere, noch spezifischere Inhibitoren der MEK können der Forschung und später auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnen.

Modulation of apoptosis by endogenously produced nitric oxide

Untersuchungen zur Expression der induzierbaren NO-Synthetase (NOS2) belegen eine häufige Expression dieses Enzyms in Tumoren unterschiedlicher Gewebe. Bislang ist jedoch ungeklärt, ob die Expression der NOS2 in Tumorzellen die apoptotische Eliminierung durch zytotoxische T-Zellen beeinflussen kann. In der vorliegenden Arbeit wurden die Folgen einer endogenen NO-Synthese auf die Apoptosesensitivität von HEK293-Zellen untersucht. Um primäre NO-Wirkungen von NO-induzierten, sekundären (kompensatorischen) Veränderungen zu trennen, wurde mit einem induzierbaren Vektorsystem gearbeitet. Die NOS2 wurde zunächst unter der Kontrolle eines Ecdyson-sensitiven Promoters in HEK293-Zellen kloniert. Es konnten regulierbare NOS2-Klone selektiert werden, die nach Ponasteronbehandlung dosisabhängig die NOS2 exprimieren und NO synthetisieren. Die NOS2-Expression wurde durch Western Blot Analyse und Immunfluoreszenzfärbung dargestellt und die NO-Produktion mit Hilfe der Griess-Reaktion gemessen. An den NOS2-induzierten Zellen wurde dann der Einfluss von NO auf die CD95-vermittelte Apoptose analysiert. Es zeigte sich nach Stimulation des CD95-Rezeptors eine deutliche Korrelation der Apoptoserate mit der NOS2-Expression. In Kokulturexperimenten mit Peptid-spezifischen zytotoxischen T-Zellen zeigte sich, dass NO-produzierende Zielzellen effektiver eliminiert werden konnten. Auch nach Behandlung der Zellen mit TRAIL ergab sich eine höhere Apoptoserate in NO-produzierenden Zellen. Die weitere Analyse der durch NO beeinflussten Signalwege ergab eine Beteiligung von ER-Stress-vermittelten Apoptosewegen. Dies zeigte sich an der Hochregulation des ER-Stress-Proteins Grp78 (BiP) nach NOS2-Expression und der Spaltung der am ER-lokalisierten Caspase-4. Darüber hinaus konnte der schnellere Verlust des mitochondrialen Membranpotentials in Abhängigkeit von der NOS2-Expression nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Wirkung einer dauerhaften NO-Exposition auf die Apoptosesensitivität der Zellen untersucht. Auch ohne zusätzliche CD95-Stimulation induzierte eine kontinuierliche NOS2-Expression nach wenigen Tagen in den EcR293-NOS2-Zellen Apoptose. Diese Dauerbehandlung führte zum nahezu vollständigen Absterben der Kulturen. Einige Zellen überlebten jedoch diese Behandlung und wuchsen zu Zellklonen. Diese NO-resistenten Klone konnten isoliert werden. Sie zeigten eine zusätzliche Resistenz für CD95-vermittelte Apoptosesignale und waren besser vor dem Angriff Peptid-spezifischer CTLs geschützt. Die Apoptoseresistenz blieb auch nach längerer Kultur erhalten und scheint auf NO-induzierter Genotoxizität zu beruhen. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch chronische NO-Behandlung eine Selektion apoptoseresistenter Zellen stattfinden kann.

Differential cell type-specific transcriptional regulation of the CYP1A1 gene

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) monooxygenase plays an important role in the metabolism of environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (HAHs). Oxidation of these compounds converts them to the metabolites that subsequently can be conjugated to hydrophilic endogenous entities e.g. glutathione. Derivates generated in this way are water soluble and can be excreted in bile or urine, which is a defense mechanism. Besides detoxification, metabolism by CYP1A1 may lead to deleterious effects since the highly reactive intermediate metabolites are able to react with DNA and thus cause mutagenic effects, as it is in the case of benzo(a) pyrene (B[a]P). CYP1A1 is normally not expressed or expressed at a very low level in the cells but it is inducible by many PAHs and HAHs e.g. by B[a]P or 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Transcriptional activation of the CYP1A1 gene is mediated by aryl hydrocarbon receptor (AHR), a basic-helix-loop-helix (bHLH) transcription factor. In the absence of a ligand AHR stays predominantly in the cytoplasm. Ligand binding causes translocation of AHR to the nuclear compartment, its heterodimerization with another bHLH protein, the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) and binding of the AHR/ARNT heterodimer to a DNA motif designated dioxin responsive element (DRE). This process leads to the transcriptional activation of the responsive genes containing DREs in their regulatory regions, e.g. that coding for CYP1A1. TCDD is the most potent known agonist of AHR. Since it is not metabolized by the activated enzymes, exposure to this compound leads to a persisting activation of AHR resulting in diverse toxic effects in the organism. To enlighten the molecular mechanisms that mediate the toxicity of xenobiotics like TCDD and related compounds, the AHR-dependent regulation of the CYP1A1 gene was investigated in two cell lines: human cervix carcinoma (HeLa) and mouse hepatoma (Hepa). Study of AHR activation and its consequence concerning expression of the CYP1A1 enzyme confirmed the TCDD-dependent formation of the AHR/ARNT complex on DRE leading to an increase of the CYP1A1 transcription in Hepa cells. In contrast, in HeLa cells formation of the AHR/ARNT heterodimer and binding of a protein complex containing AHR and ARNT to DRE occurred naturally in the absence of TCDD. Moreover, treatment with TCDD did not affect the AHR/ARNT dimer formation and binding of these proteins to DRE in these cells. Even though the constitutive complex on DRE exists in HeLa, transcription of the CYP1A1 gene was not increased. Furthermore, the CYP1A1 level in HeLa cells remained unchanged in the presence of TCDD suggesting repressional mechanism of the AHR complex function which may hinder the TCDD-dependent mechanisms in these cells. Similar to the native, the mouse CYP1A1-driven reporter constructs containing different regulatory elements were not inducible by TCDD in HeLa cells, which supported a presence of cell type specific trans-acting factor in HeLa cells able to repress both the native CYP1A1 and CYP1A1-driven reporter genes rather than species specific differences between CYP1A1 genes of human and rodent origin. The different regulation of the AHR-mediated transcription of CYP1A1 gene in Hepa and HeLa cells was further explored in order to elucidate two aspects of the AHR function: (I) mechanism involved in the activation of AHR in the absence of exogenous ligand and (II) factor that repress function of the exogenous ligand-independent AHR/ARNT complex. Since preliminary studies revealed that the activation of PKA causes an activation of AHR in Hepa cells in the absence of TCDD, the PKA-dependent signalling pathway was the proposed endogenous mechanism leading to the TCDD-independent activation of AHR in HeLa cells. Activation of PKA by forskolin or db-cAMP as well as inhibition of the kinase by H89 in both HeLa and Hepa cells did not lead to alterations in the AHR interaction with ARNT in the absence of TCDD and had no effect on binding of these proteins to DRE. Moreover, the modulators of PKA did not influence the CYP1A1 activity in these cells in the presence and in the absence of TCDD. Thus, an involvement of PKA in the regulation of the CYP1A1 Gen in HeLa cells was not evaluated in the course of this study. Repression of genes by transcription factors bound to their responsive elements in the absence of ligands has been described for nuclear receptors. These receptors interact with protein complex containing histone deacetylase (HDAC), enzyme responsible for the repressional effect. Thus, a participation of histone deacetylase in the transcriptional modulation of CYP1A1 gene by the constitutively DNA-bound AHR/ARNT complex was supposed. Inhibition of the HDAC activity by trichostatin A (TSA) or sodium butyrate (NaBu) led to an increase of the CYP1A1 transcription in the presence but not in the absence of TCDD in Hepa and HeLa cells. Since amount of the AHR and ARNT proteins remained unchanged upon treatment of the cells with TSA or NaBu, the transcriptional upregulation of CYP1A1 gene was not due to an increased expression of the regulatory proteins. These findings strongly suggest an involvement of HDAC in the repression of the CYP1A1 gene. Similar to the native human CYP1A1 also the mouse CYP1A1-driven reporter gene transfected into HeLa cells was repressed by histone deacetylase since the presence of TSA or NaBu led to an increase in the reporter activity. Induction of reporter gene did not require a presence of the promoter or negative regulatory regions of the CYP1A1 gene. A promoter-distal fragment containing three DREs together with surrounding sequences was sufficient to mediate the effects of the HDAC inhibitors suggesting that the AHR/ARNT binding to its specific DNA recognition site may be important for the CYP1A1 repression. Histone deacetylase is recruited to the specific genes by corepressors, proteins that bind to the transcription factors and interact with other members of the HDAC complex. Western blot analyses revealed a presence of HDAC1 and the corepressors mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) in both cell types, while the corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) was expressed exclusively in HeLa cells. Thus the high inducibility of CYP1A1 in Hepa cells may be due to the absence of NCoR in these cells in contrast to the non-responsive HeLa cells, where the presence of NCoR would support repression of the gene by histone deacetylase. This hypothesis was verified in reporter gene experiments where expression constructs coding for the particular members of the HDAC complex were cotransfected in Hepa cells together with the TCDD-inducible reporter constructs containing the CYP1A1 regulatory sequences. An overexpression of NCoR however did not decrease but instead led to a slight increase of the reporter gene activity in the cells. The expected inhibition was observed solely in the case of SMRT that slightly reduced constitutive and TCDD-induced reporter gene activity. A simultaneous expression of NCoR and SMRT shown no further effects and coexpression of HDAC1 with the two corepressors did not alter this situation. Thus, additional factors that are likely involved in the repression of CYP1A1 gene by HDAC complex remained to be identified. Taking together, characterisation of an exogenous ligand independent AHR/ARNT complex on DRE in HeLa cells that repress transcription of the CYP1A1 gene creates a model system enabling investigation of endogenous processes involved in the regulation of AHR function. This study implicates HDAC-mediated repression of CYP1A1 gene that contributes to the xenobiotic-induced expression in a tissue specific manner. Elucidation of these processes gains an insight into mechanisms leading to deleterious effects of TCDD and related compounds.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte.

Genetische und funktionelle Analyse von Vesikelmembranprotein-Mutanten in Maus und Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind konservierte, ubiquitär vorkommende Membranproteine synaptischer Vesikel und zytoplasmatischer Transportvesikel. Bei Säugetieren lassen sie sich in die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins) unterteilen, die im Nematoden C. elegans jeweils nur durch ein einzelnes Polypeptid vertreten sind (Synaptophysin-1 [SPH-1], Synaptogyrin-1 [SNG-1] und SCAMP-1 [SCM-1]). Obwohl den TVPs eine Beteiligung bei der Regulation des Vesikelzyklus zugesprochen wurde, sind Synaptophysin-1-Knockout-Mäuse und vollständig TVP-defiziente Würmer gesund und weisen nur geringgradige Veränderungen auf. In dieser Arbeit sollten daher zum einen genomweite komparative Transkriptomanalysen durchgeführt werden, um mögliche Kompensationsmechanismen in der Maus und C. elegans zu finden, zum anderen sollten mit Hilfe pharmakologischer Stressassays und genetischer Verfahren Schwachstellen und Redundanzen identifiziert werden. Erstaunlicherweise konnten durch Affymetrix GeneChip-Analysen der RNA in der Retina von Synaptophysin-1-/--Mäusen keine differenziell exprimierten Gene gefunden werden. Bei der Untersuchung der C. elegans-TVP-Dreifachmutante wurden hingegen 17 Gene mit erhöhter und 3 mit erniedrigter Transkription identifiziert. Die Befunde für 12 hochregulierte Gene wurden durch quantitative Real-Time RT-PCR bestätigt. Das am stärksten hochregulierte Gen arf-1.1 kodiert für eine GTPase, die vermutlich an der Regulation der Vesikelbildung beteiligt ist. Von den ebenso identifizierten Genen cdr-2, cdr-4 und pgp-9 ist bekannt, dass sie in Stresssituationen, z. B. in Gegenwart von Cadmium, verstärkt transkribiert werden. ugt-62 und ugt-19 kodieren für Glucuronosyltransferasen. Für arf-1.1, cdr-2, ugt-62 sowie für das Gen T16G1.6, das für eine coiled-coil-Domäne kodiert, wurden im Folgenden fluoreszierende Promoterkonstrukte hergestellt, um Koexpressionsmuster mit TVPs zu bestimmen. Es stellte sich heraus, dass alle vier Promoterkonstrukte im Darm zusammen mit SPH-1 und SCM-1 im Darm transkribiert werden. Mit fluoreszierenden Translationschimären konnte weiterhin gezeigt werden, dass ARF-1.1 und CDR-2 mit den Darm-spezifischen TVPs im apikalen Bereich der Darmzellen kolokalisieren. Um mehr über die Funktion von TVPs im Vesikelzyklus zu erfahren, wurden pharmakologische und genetische Analysen von Würmern durchgeführt, in denen die Expression des Neuronen-spezifischen SNG-1 verändert ist. Deletion oder Überexpression führte zu einer Resistenz gegenüber dem Acetylcholinesterase-Inhibitor Aldicarb und zu erhöhter Empfindlichkeit gegenüber dem GABA-Rezeptor-Antagonisten Pentylentetrazol. Auf genetischer Ebene zeigte sich, dass sng-1 synthetisch mit den Genen für Synaptotagmin-1, Endophilin A sowie Synaptojanin wirkt. Die beobachteten Effekte weisen auf alternative Funktionen in der synaptischen Übertragung hin und unterstützen zugleich die Hypothese, dass SNG-1 im synaptischen Vesikelzyklus eine wichtige Funktion erfüllt, die möglicherweise einem noch unbekannten redundanten Kompartiment-spezifischen Signalweg der synaptischen Transmission zuzuordnen ist.

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schlüsselmolekül zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine große Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in frühen Phasen als Tumorsuppressor, währenddessen es in späten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher für ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Spleißform des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. Für diese Spleißform konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Überexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine veränderte Lokalisation der Smurf2 Spleißformen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Spleißen des Exons2 führte dabei zu Änderungen der Topologie der N-terminalen C2-Domäne, wodurch sich eine veränderte Lokalisation in der Zelle beschreiben ließ. Mit der veränderten intrazellulären Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine Änderung. So konnte überraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine Überexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verstärkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegenüber TGF-beta. Dies führte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse bestätigt werden konnte, daß das dE2Smurf2 nach Überexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abhängig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, daß durch die höhere Sensitivität gegenüber TGF-beta naive T-Zellen unter Einfluß von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, daß die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INFγ produzierten.So zeigten in vivo Versuche, daß die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entzündung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine stärkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INFγ und Granzym B erklärt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten Mäuse, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant stärkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer Überproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erklärt werden. Klonierungsexperimente führten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell über die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein für die Modulation von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

Die Rolle des anti-apoptotischen Proteins Mcl-1 für die Leber und das hepatozelluläre Karzinom

Myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) ist ein anti-apoptotisches Mitglied der Bcl-2-Proteinfamilie. Als solches ist es in der Lage, die mitochondriale Aktivierung während der Apoptose zu hemmen. Dadurch schützt es Zellen bei zellulärem Stress (wie z.B. Differenzierung, Proliferation oder Virusinfektion) vor Apoptoseinduktion. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es unabkömmlich während der Embryogenese und in verschiedenen hämatopoetischen Zellpopulationen. Des Weiteren ist Mcl-1 als Protoonkogen in verschiedenen humanen Tumorentitäten verstärkt exprimiert und kann so zu einer verminderten Apoptosesensitivität von Tumorzellen beitragen. Auch primäre humane Hepatozyten können nach Mcl-1-Induktion durch Wachstumsfaktorbehandlung gegenüber CD95-vermittelter Apoptose geschützt werden. Daher sollte untersucht werden, welche Bedeutung Mcl-1 im hepatozellulären Karzinom (HCC) und in der gesunden Leber einnimmt. Hierzu wurde zunächst humanes HCC-Gewebe hinsichtlich der Expression von Mcl-1 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Mcl-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene in HCC-Gewebe verstärkt exprimiert ist im Vergleich zu benachbartem Normalgewebe. Auch in verschiedenen HCC-Zelllinien konnte eine starke Mcl-1-Expression nachgewiesen werden. Diese war vor allem über den PI3K/Akt-Signalweg reguliert. Eine Hemmung dieses Signalwegs führte zu einer Reduktion der Mcl-1-Expression und so zu einer Sensitivierung der Zellen gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika und zielgerichteten Therapien. Des Weiteren wurde die Mcl-1-Expression spezifisch durch RNA-Interferenz gehemmt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass Zellen mit unterdrückter Mcl-1-Expression deutlich sensitiver gegenüber verschiedenen Apoptose-induzierenden Substanzen reagierten. Eine kombinierte Hemmung der Mcl-1-Expression und der PI3-Kinase führte schließlich zu einer nochmals verstärkten Sensitivierung. Im Gegensatz dazu führte eine Überexpression von Mcl-1 zu einer Hemmung der Apoptoseinduktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine Mauslinie etabliert, welche spezifisch in Hepatozyten kein Mcl-1 exprimiert, um so die Bedeutung von Mcl-1 für die Leber in vivo zu untersuchen. Es zeigte sich, dass Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäuse bereits im Alter von acht Wochen eine verminderte Lebergröße aufweisen. Dies wurde verursacht durch spontane Apoptoseinduktion in den Mcl-1 negativen Hepatozyten. Hierdurch kam es zu einer Leberschädigung, ersichtlich durch erhöhte Transaminasenwerte, erhöhte Caspase-3-Aktivierung, und Schädigung der Gewebsstruktur. Zudem war als kompensatorischer Effekt die Zellproliferation erhöht, ohne dass sich jedoch das Lebergewicht an das von Kontrolltieren anglich. Interessanterweise kam es in Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäusen als Folge der chronischen Leberschädigung zur Entwicklung einer Leberfibrose, ersichtlich durch eine verstärkte Collageneinlagerung. Weiterhin reagierten Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäuse wesentlich empfindlicher gegenüber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose. Diese Daten zeigen zum einen, dass Mcl-1 zur Apoptoseresistenz von HCC-Zellen beitragen kann. Zielgerichtete Therapien, welche die Expression von Mcl-1 hemmen, könnten folglich für die Therapie des HCCs von Interesse sein. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Mcl-1 ein zentraler anti-apoptotischer Faktor für Hepatozyten in vivo ist.

Methods and strategies to identify the mode of action of phytoactive compounds

Small molecules affecting biological processes in plants are widely used in agricultural practice as herbicides or plant growth regulators and in basic plant sciences as probes to study the physiology of plants. Most of the compounds were identified in large screens by the agrochemical industry, as phytoactive natural products and more recently, novel phytoactive compounds originated from academic research by chemical screens performed to induce specific phenotypes of interest. The aim of the present PhD thesis is to evaluate different approaches used for the identification of the primary mode of action (MoA) of a phytoactive compound. Based on the methodologies used for MoA identification, three approaches are discerned: a phenotyping approach, an approach based on a genetic screen and a biochemical screening approach.rnFour scientific publications resulting from my work are presented as examples of how a phenotyping approach can successfully be applied to describe the plant MoA of different compounds in detail.rnI. A subgroup of cyanoacrylates has been discovered as plant growth inhibitors. A set of bioassays indicated a specific effect on cell division. Cytological investigations of the cell division process in plant cell cultures, studies of microtubule assembly with green fluorescent protein marker lines in vivo and cross resistant studies with Eleusine indica plants harbouring a mutation in alpha-tubulin, led to the description of alpha-tubulin as a target site of cyanoacrylates (Tresch et al., 2005).rnII. The MoA of the herbicide flamprop-m-methyl was not known so far. The studies described in Tresch et al. (2008) indicate a primary effect on cell division. Detailed studies unravelled a specific effect on mitotic microtubule figures, causing a block in cell division. In contrast to other inhibitors of microtubule rearrangement such as dinitroanilines, flamprop-m-methyl did not influence microtubule assembly in vitro. An influence of flamprop-m-methyl on a target within the cytoskeleton signalling network could be proposed (Tresch et al., 2008).rnIII. The herbicide endothall is a protein phosphatase inhibitor structurally related to the natural product cantharidin. Bioassay studies indicated a dominant effect on dark-growing cells that was unrelated to effects observed in the light. Cytological characterisation of the microtubule cytoskeleton in corn tissue and heterotrophic tobacco cells showed a specific effect of endothall on mitotic spindle formation and ultrastructure of the nucleus in combination with a decrease of the proliferation index. The observed effects are similar to those of other protein phosphatase inhibitors such as cantharidin and the structurally different okadaic acid. Additionally, the observed effects show similarities to knock-out lines of the TON1 pathway, a protein phosphatase-regulated signalling pathway. The data presented in Tresch et al. (2011) associate endothall’s known in vitro inhibition of protein phosphatases with in vivo-effects and suggest an interaction between endothall and the TON1 pathway.rnIV. Mefluidide as a plant growth regulator induces growth retardation and a specific phenotype indicating an inhibition of fatty acid biosynthesis. A test of the cuticle functionality suggested a defect in the biosynthesis of very-long-chain fatty acids (VLCFA) or waxes. Metabolic profiling studies showed similarities with different groups of VLCFA synthesis inhibitors. Detailed analyses of VLCFA composition in tissues of duckweed (Lemna paucicostata) indicated a specific inhibition of the known herbicide target 3 ketoacyl-CoA synthase (KCS). Inhibitor studies using a yeast expression system established for plant KCS proteins verified the potency of mefluidide as an inhibitor of plant KCS enzymes. It could be shown that the strength of inhibition varied for different KCS homologues. The Arabidopsis Cer6 protein, which induces a plant growth phenotype similar to mefluidide when knocked out, was one of the most sensitive KCS enzymes (Tresch et al., 2012).rnThe findings of my own work were combined with other publications reporting a successful identification of the MoA and primary target proteins of different compounds or compound classes.rnA revised three-tier approach for the MoA identification of phytoactive compounds is proposed. The approach consists of a 1st level aiming to address compound stability, uniformity of effects in different species, general cytotoxicity and the effect on common processes like transcription and translation. Based on these findings advanced studies can be defined to start the 2nd level of MoA characterisation, either with further phenotypic characterisation, starting a genetic screen or establishing a biochemical screen. At the 3rd level, enzyme assays or protein affinity studies should show the activity of the compound on the hypothesized target and should associate the in vitro effects with the in vivo profile of the compound.

Funktionelle Charakterisierung der Casein Kinase 2 in der Etablierung und Aufrechterhaltung peripherer Toleranz durch dendritische Zellen

Dendritische Zellen (DCs) nehmen eine Schlüsselrolle in unserem Immunsystem ein, indem DCs sowohl Immunität, als auch Toleranz induzieren können. Im Falle der Immunität sind DCs in der Lage die Differenzierung der verschiedenen T-Helferzellen, wie Th1-, Th2- und Th17-Zellen zu steuern und tragen so zu der Qualität einer Immunantwort bei. Auf der anderen Seite können DCs in Gegenwart von TGF-β, IDO und Retinsäure die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen induzieren und tragen somit zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz bei. Insbesondere in den Darm-assoziierten lymphatischen Geweben (GALT) müssen DCs unverhältnismäßige Immunantworten gegen harmlose Antigene aus der Nahrung und kommensale Bakterien verhindern, während gegen Pathogene schützende Immunantworten induziert werden müssen. Auf Grund dieser entgegengesetzten Funktionen der DCs wollten wir die molekularen Mechanismen der DCs untersuchen, die der Regulation von Immunität und Toleranz zu Grunde liegen. Insbesondere der Wnt-Signalweg ist für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz im GALT von Bedeutung. Da die Casein Kinase 2 in diesem Signalweg entscheidend beteiligt ist, haben wir die CK2-Funktion konditionell, unter der Kontrolle des CD11c-Promotors, deletiert. Hierfür haben wir CD11c-cre Mäuse mit Mäusen verpaart, welche ein von loxP-Signalsequenzen flankiertes Ck2β Gen (CK2β-fl/fl) tragen. Die konditionelle Deletion der CK2-Funktion in DCs, führte zu einer verstärkten Expression der kostimulatorischen Moleküle (wie CD40, CD80, CD86) und der Zytokine IL-6 und IL-12 unter „steady-state“ Bedingungen. Detaillierte Untersuchungen der T-Zellen in CD11c-cre x CK2β-fl/fl Mäusen zeigte eine deutlich reduzierte naive T-Zellpopulation, einhergehend mit einer erhöhten Th1- und Th17-Differenzierung. Speziell in den mesenterialen Lymphknoten konnte eine höhere Frequenz von T-bet+ und Rorγt+ CD4+ T-Zellen gefunden werden, welche große Mengen der Zytokine IFN-γ und IL-17 nach ex vivo Stimulation produzierten. Weiterführende in vivo Versuche, hier wurde das Modell der oralen Toleranz gewählt, zeigten das eine CK2-Deletion in DCs die Induktion einer oralen Toleranz verhindert. Unsere Daten zeigen eindeutig, dass die CK2 entscheidend in der Regulation der DC Homöostase und der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz beteiligt ist.

Regulation des Proteins Alpha-Synuclein während der zellulären Alterung

α-Synuclein wird durch Mutationen sowie der Ausbildung von Proteinaggregaten namens Lewy-Körperchen mit der Entstehung der altersassoziierten Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Sowohl familiäre als auch sporadische Fälle sind durch erhöhte α-Synuclein-Spiegel gekennzeichnet. In familiären Fällen wurden Multiplikationen des α-Synuclein-Gens als Ursache für die erhöhte Expression aufgedeckt. In sporadischen Fällen stellt die Alterung den entscheidenden Risikofaktor für die Entstehung der Krankheit dar. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Regulation von α-Synuclein während der zellulären Alterung in humanen Fibroblasten untersucht. In seneszenten Zellen konnte ein Anstieg der α-Synuclein-Expression nachgewiesen werden, der jedoch die Löslichkeit des Proteins nicht veränderte. Damit scheint die zelluläre Alterung per se nicht für die Aggregation des Proteins, wie sie in Form von Lewy-Körperchen bei z. B. Patienten der Parkinson-Krankheit beobachtet wird, verantwortlich zu sein. Möglicherweise ist die Hochregulation von α-Synuclein eine Folge der Akkumulation von DNA-Schäden in den seneszenten Zellen. Diese Korrelation konnte in jungen Zellen nach dem Einsatz verschiedener DNA-schädigender Agenzien bestätigt werden. Die Untersuchung des Regulationsmechanismus ergab, dass die erhöhte Expression von α-Synuclein in Folge von DNA-Schäden über den ERK1/2-MAPK-Signalweg vermittelt wird. In seneszenten Zellen konnte ebenfalls ein Einfluss dieses Signalweges auf die Expression von α-Synuclein beobachtet werden, allerdings scheint dieser nicht alleinig für die Hochregulation verantwortlich zu sein. Des Weiteren ergab die Betrachtung des γH2A.X-Spiegels nach Induktion von DNA-Schäden, dass α-Synuclein möglicherweise eine protektive Funktion besitzt, da dessen Überexpression zu einer verringerten und die Herunterregulation zu einer vermehrten DNA-Schädigung führte. Die Analyse der subzellulären Lokalisation von α-Synuclein ergab außerdem, dass es in jungen Zellen nach der Induktion von DNA-Schäden zu einer Translokation des Proteins in den Zellkern kommt. Diese Translokation war in seneszenten Zellen verringert. Dies lässt vermuten, dass α-Synuclein in jungen Zellen nach DNA-Schädigung durch den ERK1/2-MAPK-Signalweg hochreguliert wird und durch die Translokation in den Zellkern möglicherweise die Transkription von protektiven Genen beeinflusst oder an DNA-Reparatur-Prozessen beteiligt ist. In seneszenten Zellen ist das Protein zwar deutlich stärker exprimiert, der Transport in den Zellkern jedoch verringert, wodurch die protektive Wirkung im Zellkern herabgesetzt wäre.

Untersuchungen zur Bedeutung von Histidinkinasen in Magnaporthe oryzae und zum Wirkmechanismus des Fungizids Fludioxonil

Das aus wissenschaftlicher und ökonomischer Sicht wichtigste Pflanzenpathogen M. oryzae entwickelte im Laufe der Evolution konservierte aber auch einzigartige Mechanismen zur Signaltransduktion. Das Erforschen dieser Mechanismen und Prozesse ist essenziell für das Verständnis von Differenzierungsprozessen bei der Pathogen-Wirt-Interaktion.rnIm ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Signalweg zur Osmoregulation, der „High Osmolarity Glycerol“ (HOG)-Signalweg, erstmals anhand physiologischer Experimente in entsprechenden Mutantenstämmen in M. oryzae untersucht. Dabei konnten klare Unter-schiede zum HOG-Signalweg von S. cerevisiae aufgezeigt werden. rnDas in M. oryzae bisher noch nicht beschriebene Gen MoYPD1, welches das Phosphotransferprotein MoYpd1p kodiert, wurde erfolgreich inaktiviert. Diese Inaktivierung ist in S. cerevisiae und vielen anderen Pilzen letal und resultierte bei M. oryzae in einer apathoge¬nen Albinomutante, deren Konidiogenese gestört ist. Insbesondere die Funktion des Phosphotransferproteins MoYpd1p, sowohl im Phosphorelaysystem des HOG-Signal¬wegs als auch im Wirkmechanismus des Fungizids Fludioxonil, konnte eindeutig mittels Y2H- und Western Blot-Analysen nachgewiesen werden.rnEs wurden entscheidende Fortschritte für das Verständnis des Aufbaus und der Funktion des HOG-Signalwegs sowohl als physiologisches Regulationssystem für Umweltreize als auch als Fungizidtarget im Pflanzenschutz erzielt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zweikompo-nenten-Hybrid-Histidinkinase (HIK) MoSln1p als Signalsensor für Salzstress und MoHik1p als Signalsensor für Zuckerstress fungiert. Die Beteiligung der Histidinkinasen MoHik5p und MoHik9p als Sensorproteine für Hypoxie im HOG-Signalweg ist durchaus denk¬bar und wurde durch erste Ergebnisse bekräftigt. rnSo konnte der HOG-Signalweg in mehreren Modellen dargestellt werden. Die Modelle der Signalerkennung und –transduktion von osmotischem Stress, von Hypoxie und der Wirkmecha¬nismus von Fludioxonil wurden erstmals in diesem Umfang für M. oryzae ausgearbei¬tet.rnDer zweite Teil dieser Arbeit repräsentiert die erste umfassende Untersuchung aller zehn HIK-codierender Gensequenzen, die im Genom von M. oryzae identifiziert werden konnten. Diese Signalproteine waren bisher noch nicht Gegenstand wissenschaftlicher Studien. Die Untersuchung beginnt mit einer phylogenetischen Einordnung aller untersuchten Proteinsequen¬zen in die verschiedenen Gruppen von Histidinkinasen in Pilzen. Eine ausführli-che phänotypische Charakterisierung aller HIK-codierender Gene folgt und wurde anhand von Mutanten durchgeführt, in denen diese Gene einzeln inaktiviert wurden.rnDie Beteiligung von MoHik5p und MoHik9p als mögliche Sauerstoffsensoren im HOG-Signal-weg konnte dokumentiert werden und die anschließenden Western Blot-Analysen bestätig¬ten erstmals die Aktivierung des HOG-Signalwegs bei hypoxieähnlichen Zuständen.rnDes Weiteren wurden mit MoHik5p und MoHik8p zwei neue Pathogenitätsfaktoren in M. oryzae identifiziert. Die apathogenen Mutantenstämme ΔMohik5 und ΔMohik8 sind in der Konidiogenese gestört und nicht in der Lage Appressorien zu differenzieren. Der Einsatz dieser Proteine als Fungizidtarget im protektiven Pflanzenschutz in der Zukunft ist somit denk-bar.rn

Einfluss des Treg-Aktivierungsmarkers GARP auf die Differenzierung und Funktion von T-Zellen

CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine essentielle Rolle bei der Unterdrückung von schädlichen Immunreaktionen. Da aktivierte CD4+ T-Helferzellen auch CD25 und FoxP3 exprimieren, können diese nicht als spezifische Marker zur Identifikation von Treg verwendet werden. Die Analyse der Membranproteinexpression beider Populationen führte zur Identifikation von GARP (glycoprotein A repetitions predominant) als spezifischer Marker auf aktivierten Treg. GARP bindet LAP und TGF-beta, welches für die Unterdrückung von entzündlichen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Um die Funktion von GARP unabhängig von Treg zu untersuchen, wurde ein lösliches GARP Protein (sGARP) synthetisiert und sein Effekt auf die Aktivierung und Differenzierung von humanen T-Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sGARP die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen supprimiert und zu einer Phosphorylierung von SMAD2/3 sowie zu der Induktion von FoxP3 führt. Zusätzlich inhibiert sGARP die Produktion von Effektorzytokinen wie IL-2 und IFN-gamma. Die Stimulation von naiven CD4+ T-Zellen mit sGARP induziert die Differenzierung zu Treg, welche in Kokultur die Aktivierung von T-Effektorzellen supprimieren. Die Wirkung war vergleichbar in naiven CD4+ und ruhenden CD4+CD45RA+ T-Zellen, konnte aber in differenzierten CD4+CD45RO+ T-Zellen nicht nachgewiesen werden. Die Induktion von FoxP3 und die Phosphorylierung von SMAD2/3 konnte durch eine Blockade des TGF-beta-Signalweges inhibiert werden. Dies lässt vermuten, dass die Funktion von sGARP zumindest teilweise von TGF-beta abhängig ist. Zusätzlich zu seiner passiven Rolle als TGF-beta-Transporter, induzierte sGARP die TGF-beta-Produktion in naiven T-Zellen und trägt so zum Mechanismus der infektiösen Toleranz bei. Des Weiteren fördert die Stimulation von sGARP in Anwesenheit von IL-6 und IL-23 die Differenzierung zu Th17 Zellen. rnNeben dem Einfluss von sGARP auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, supprimiert sGARP die Proliferation und Granzyme B-Expression in CD8+ T-Zellen. rnFür die Analyse der immunmodulatorischen Funktion von sGARP in vivo wurde ein Modell einer xenogenen GvHD (graft-versus-host disease) verwendet. Der Transfer von humanen PBMC in neugeborene, immundefiziente Rag2-/-gamma-chain-/--Mäuse führt zu einer letalen GvHD, welche durch die Applikation von humanen Treg dosisabhängig unterdrückt werden kann. In diesem Modell konnte die repetitive Gabe von sGARP, ohne zusätzliche Zugabe von Treg, ebenfalls die GvHD unterdrücken. Dies lässt auf einen synergistischen Effekt von sGARP und Treg bei der Suppression inflammatorischer T-Zellantworten schließen. rnZusammengefasst lassen die Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von GARP in der Modulation der peripheren Toleranz folgern und zeigen sGARP als potentes Biological für die Behandlung von unerwünschten inflammatorischen Immunantworten.

Interplay between BDNF,TrkB signalling and GABAergic inhibition in the visual cortex of mice

Der visuelle Kortex ist eine der attraktivsten Modellsysteme zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der synaptischen Plastizität im Gehirn. Es hat sich gezeigt, dass der Wachstumsfaktor brain-derived-neurotrophic-factor (BDNF) und die GABAerge Hemmung während der Entwicklung eine essentielle Funktion in der Regulierung der synaptischen Plastizität im visuellen Kortex besitzen. BDNF bindet u.a. an TrkB Rezeptoren, die das Signal intrazellular an unterschiedliche Effektormoleküle weiter vermitteln. Außer BDNF sind auch andere TrkB-Rezeptor Agonisten in der Literatur beschrieben. Einer davon ist das kürzlich identifizierte Flavonoid 7,8-Dihydroxyflavone (7,8-DHF), welchem eine neurotrophe Wirkung zugeschrieben wird. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Doktorarbeit wurde der Effekt dieses Agonisten auf die synaptische Übertragung und intrinsischen Zelleigenschaften im visuellen Kortex der Maus untersucht. Dies wurde mit Hilfe der whole-cell patch clamp Methode durchgeführt, wobei die synaptischen Eingänge der Pyramidalzellen der kortikalen Schicht 2/3 von besonderem Interesse waren.rnEine 30 minütige Inkubationszeit der kortikalen Schnitte mit 7,8 DHF (20µM) erzielte eine signifikante Reduktion der GABAergen Hemmung, während die glutamaterge synaptische Übertragung unverändert blieb. Des weiteren konnte in Gegenwart von 7,8 DHF eine Veränderung der intrinsischen neuronalen Zellmembraneigenschaften beobachtet werden. Dies wurde deutlich in der Erhöhung des Eingangwiderstandes und der Frequenz der induzierten Aktionspotentiale. Die chronische Applikation von 7,8 DHF in vivo bestätigte die selektive Wirkung von 7,8 DHF auf das GABAerge System. rnDie Rolle des BDNF-TrkB-Signalweges in der GABAergen Hemmung nach kortikalen Verletzungen ist bisher wenig verstanden. Eine häufig beschriebene elektrophysiologische Veränderung nach kortikaler Verletzung ist eine Reduktion in der GABAergen Hemmung. Im zweiten Abschnitt dieser Doktorarbeit wurde hierzu die Funktion des BDNF-TrkB-Signalweges auf die GABAerge Hemmung nach kortikaler Verletzung untersucht. Es wurde ein "ex-vivo/in-vitro“ Laser-Läsions Modell verwendet, wobei mittels eines Lasers im visuellen Kortex von WT und heterozygoten BDNF (+/−) Mäusen eine definierte, reproduzierbare Läsion induziert wurde. Nachfolgende elektrophysiologische Messungen ergaben, dass die Auswirkung einer Verletzung des visuellen Kortex auf die GABAerge Funktion signifikant von der basalen BDNF Konzentration im Kortex abhängt. Des weiteren konnte beobachtet werden, dass nach kortikaler Verletzung in WT Mäusen sowohl die Frequenz der basalen inhibitorischen, postsynaptischen Potentiale (mIPSCs) reduziert war, als auch ein erhöhtes Paired-Pulse Verhältnis vorlag. Diese Ergebnisse deuten auf Veränderungen der präsynaptischen Funktion inhibitorischer Synapsen auf Pyramidalneurone hin. Im Gegensatz dazu konnte in BDNF (+/−) mice Mäusen eine erhöhte und gleichzeitig verlängerte mIPSC-Amplitude beobachtet werden, induziert durch Reizung afferenter Nervenfasern. Hieraus lässt sich schließen, dass kortikale Verletzungen in BDNF (+/−) mice Mäusen Auswirkungen auf die Eigenschaften von postsynaptischen GABAA-Rezeptoren haben. Die nachfolgende Gabe eines TrkB-Rezeptor Antagonisten bestätigte diese Ergebnisse für das GABAerge System post-Läsion. Dies zeigt auch, dass die Änderungen der synaptischen Hemmung nicht auf eine Reduktion der BDNF-Konzentration zurückzuführen sind. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass der BDNF-TrkB Signalweg eine wichtige Rolle in der Reorganisation der GABAergen Hemmung nach kortikalen Verletzungen spielt. So könnte ein TrkB-Rezeptor Agonist, wie das kürzlich entdeckte 7,8-DHF, über eine Modulation der BDNF-TrB Signalkaskade pharmakologisch die funktionelle Reorganisation des Kortex nach einer fokalen Gehirnverletzung fördern. rnrn