Sprühgetrocknete Polylaktid, Poly(laktid-co-glykolid) Mikropartikel zur Steuerung der Freisetzung aus pulmonalen Arzneiformen

Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, pharmazeutisch-technologische Möglichkeiten der Retardierung bei ausgewählten Antiasthmatika zur pulmonalen Applikation anzuwenden. Dafür sollten Mikropartikel hergestellt und pharmazeutisch sowie biopharmazeutisch charakterisiert werden. Als Modellsubstanzen werden das Glukokortikoid Budesonid und das β2-Sympathomimetikum Salbutamol in Form seiner Base und seines Salzes verwendet. Die Auswahl erfolgt nach physikochemischen (Lipophilie, Molekulargewicht) und therapeutischen (Halbwertszeit der Wirkung, Applikationsfrequenz) Gesichtspunkten. Mikropartikel auf Polymerbasis ermöglichen eine kontrollierte Freigabe der Arzneistoffe über einen vorausbestimmten Zeitraum. Es erfolgt die Auswahl physiologisch unbedenklicher Hilfsstoffe (Polylaktide R 202H/ Poly(laktid-co-glykolide) RG 502H, RG 752-S) mit unterschiedlichen Anteilen an Coglykolid sowie unterschiedlichen Molekulargewichten, die sich prinzipiell zur Verzögerung der Freisetzung eignen und sich bei der parenteralen Applikation bereits bewährt haben. Die Sprühtrocknung wird als geeignetes pharmazeutisch-technologisches Verfahren zur Präparation von Mikropartikeln im Teilchengrößenbereich von 1- 10 Mikrometern beschrieben, welche den Wirkstoff mit möglichst hoher Beladung verkapselt. Die sprühgetrockneten Pulver sollen pharmazeutisch physikochemisch mittels Rasterelektronenmikroskopie (Morphologie), Laserdiffraktometrie (Teilchengrößenverteilung), DSC und Röntgenpulverdiffraktometrie (thermisches Verhalten) und mittels Stickstoff-Tief-Temperatur Adsorptionsverfahren (spezifische Oberfläche) charakterisiert werden. Zusätzlich wird die Wirkstoffbeladung der sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikel mittels HPLC ermittelt. Die biopharmazeutische Charakterisierung der sprühgetrockneten Pulver erfolgt über die in-vitro Freigabekinetik und die Stabilität der Mikropartikel. Zusätzlich werden Versuche an Zellkulturen und in-vivo Versuche an Mäusen durchgeführt, um die Effekte der sprühgetrockneten Mikropartikel und des Hilfsstoffs hinsichtlich der Freisetzungsretardierung zu testen. Bei den in-vivo Versuchen werden der Atemwegswiderstand und die Verlängerung der exspiratorischen Phase (penh) als Parameter für einen antiasthmatischen Effekt gewählt. Die Lungenlavage Flüssigkeit wird zusätzlich überprüft. Die Ergebnisse zeigen, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung möglich ist, Polymer-Mikropartikel herzustellen, die aufgrund ihrer Partikelgröße von d50 ≤ 5,8 µm fähig sind, die unteren Abschnitte der Lunge zu erreichen. Die Morphologie der Mikropartikel ist abhängig vom zu versprühenden Produkt. Thermodynamisch und röntgenpulverdiffraktometrisch betrachtet handelt es sich um amorphe Produkte, die aber über lange Zeit in diesem Zustand stabil sind. Die Wiederfindung der eingesetzten Arzneistoffmenge in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln und die Freigabeversuche zur Charakterisierung der Retardierungseigenschaften der verwendeten Polymere ergeben, dass es mit Hilfe der Sprühtrocknung von Budesonid und Salbutamol mit den Polymeren möglich ist, retardierende Mikropartikel herzustellen. Die Wiederfindung von Budesonid und Salbutamol in den sprühgetrockneten Polymer-Mikropartikeln entspricht nahezu der eingesetzten Menge. Bei Salbutamolsulfat ist dies nicht der Fall. In Zellkulturversuchen der murinen Zellinie RAW 264.7 ergaben sich Hinweise darauf, dass bei Konzentrationen von 10-6 M und 10-8 M, die Downregulation der IL-6 Konzentration durch die Sprüheinbettung von 9,1 % Budesonid mit PLGA in stärkerem Ausmaß erfolgte, als bei unverkapseltem Budesonid. Zusätzlich wurden in-vivo Versuche mit intranasaler und intraperitonealer Gabe durchgeführt. Die Budesonid-Polymer Sprüheinbettung wurde mit unverkapseltem Budesonid vergleichen. Nach intraperitonealer Gabe hatte die Sprüheinbettung mit Budesonid die besten Effekte hinsichtlich der Unterdrückung des penh und des Atemwegswiderstands auch bei steigenden Metacholinkonzentrationen. Die Auswertung der Lungenlavage Flüssigkeit zeigt sehr deutlich die Downregulation der IL-6 Konzentration in der Lunge durch die Sprüheinbettung mit Budesonid. Zur Zeit werden Vorbereitungen getroffen, ein Gerät zu testen, das in der Lage ist, ein Mikrospray zu generieren, so dass eine intratracheale Verabreichung möglich wäre.

Dynamic wetting of complex liquids

A simple dependency between contact angle θ and velocity or surface tension has been predicted for the wetting and dewetting behavior of simple liquids. According to the hydrodynamic theory, this dependency was described by Cox and Voinov as θ ∼ Ca^(1/3) (Ca: Capillary number). For more complex liquids like surfactant solutions, this prediction is not directly given.rnHere I present a rotating drum setup for studying wetting/dewetting processes of surfactant solutions on the basis of velocity-dependent contact angle measurements. With this new setup I showed that surfactant solutions do not follow the predicted Cox-Voinov relation, but showed a stronger contact angle dependency on surface tension. All surfactants independent of their charge showed this difference from the prediction so that electrostatic interactions as a reason could be excluded. Instead, I propose the formation of a surface tension gradient close to the three-phase contact line as the main reason for the strong contact angle decrease with increasing surfactant concentration. Surface tension gradients are not only formed locally close to the three-phase contact line, but also globally along the air-liquid interface due to the continuous creation/destruction of the interface by the drum moving out of/into the liquid. By systematically hindering the equilibration routes of the global gradient along the interface and/or through the bulk, I was able to show that the setup geometry is also important for the wetting/dewetting of surfactant solutions. Further, surface properties like roughness or chemical homogeneity of the wetted/dewetted substrate influence the wetting/dewetting behavior of the liquid, i. e. the three-phase contact line is differently pinned on rough/smooth or homogeneous/inhomogeneous surfaces. Altogether I showed that the wetting/dewetting of surfactant solutions did not depend on the surfactant type (anionic, cationic, or non-ionic) but on the surfactant concentration and strength, the setup geometry, and the surface properties.rnSurfactants do not only influence the wetting/dewetting behavior of liquids, but also the impact behavior of drops on free-standing films or solutions. In a further part of this work, I dealt with the stability of the air cushion between drop and film/solution. To allow coalescence between drop and substrate, the air cushion has to vanish. In the presence of surfactants, the vanishing of the air is slowed down due to a change in the boundary condition from slip to no-slip, i. e. coalescence is suppressed or slowed down in the presence of surfactant.

Intrazelluläre Lokalisation und synaptische Ausschüttung der Neurotrophine in hippokampalen Neuronen und die Bedeutung von BDNF bei hippokampaler synaptischer Plastizität

Die Mitglieder der Neurotrophin-Familie (NGF, BDNF, NT-3 und NT-4) sind sekretierte Neuropeptide, die eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung von Nervenzellen und bei der Modulation der synaptischen Transmission spielen. Wenngleich eine aktivitätsabhängige Sekretion von BDNF bereits gezeigt werden konnte, wurden die subzelluläre Expression und die Ausschüttung der anderen Neurotrophine bislang nur unzureichend charakterisiert. Um die Expression und die Ausschüttung aller Neurotrophine unter identischen Bedingungen untersuchen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit das Expressionsmuster und die synaptische Ausschüttung GFP-markierter Neurotrophine in dissoziierten hippokampalen Neuronen mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenz-Videomikroskopie zeitaufgelöst untersucht. Zwei Phänotypen konnten unterschieden werden: der distale vesikuläre Expressionstyp mit Neurotrophin-beinhaltenden Vesikeln in distalen Neuriten, und der proximale Expressionstyp mit einer diffusen Neurotrophin-Verteilung in den Neuriten und Neurotrophin-beinhaltenden Vesikeln im Soma des Neurons und in den proximalen Dendriten. Der distale vesikuläre Phänotyp entsprach einer Verteilung des entsprechenden Neurotrophins in die sekretorischen Granula des aktivitätsabhängigen Sekretionsweges, während der proximale Phänotyp den Transport eines Neurotrophins in den konstitutiven Sekretionsweg widerspiegelte. Alle Neurotrophine erreichten in hippokampalen Neuronen prinzipiell beide Sekretionswege. Jedoch gelangten BDNF und NT-3 mit einer größeren Effizienz in den regulierten Sekretionsweg als NT-4 und NGF (BDNF: in 98% aller Zellen, NT-3: 85%, NT-4: 23% und NGF: 46%). Neurotrophine besitzen, wie es für sekretorische Peptide üblich ist, eine Vorläufersequenz, die während der Reifung des Proteins proteolytisch abgespalten wird. Die Fusion dieser Präpro-Sequenz von BDNF mit der Sequenz des maturen NT-4 bewirkte einen effizienteren Transport von NT-4 in die sekretorischen Granula des regulierten Sekretionsweges, und zeigte die große Bedeutung der Präpro-Sequenz für das zelluläre Verteilungsmuster von Neurotrophinen. In Neuronen, in denen die Neurotrophine in den regulierten Sekretionsweg transportiert wurden, konnte eine aktivitätsabhängige Sekretion der Neurotrophine an postsynaptische Strukturen glutamaterger Synapsen beobachtet werden. Die aktivitätsabhängige postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine zeigte eine Heterogenität in der Kinetik der Sekretion (exponentieller Abfall des Neurotrophin-Signals mit Zeitkonstanten von tau = 121 bis 307s). Die Präinkubtion mit dem Protonen-Ionophor Monensin, welcher die Neutralisation des intragranulären pH-Wertes und somit die Solubilisierung der dicht gepackten Proteinstrukturen in den Vesikeln erzwingt, erhöhte die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung auf den Wert des unter physiologischen Bedingungen schnellsten Neurotrophins NT-4. Dennoch blieb die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung im Vergleich zur Neurotransmitter-Ausschüttung langsam (tau = 13 ± 2 s). Diese Daten belegen eindeutig, dass die Neutralisation der sekretorischen Granula die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung kritisch determiniert und die Geschwindigkeit der Neurotrophin-Ausschüttung im Vergleich zur konventionellen Neurotransmitter-Ausschüttung langsam erfolgt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Neurotrophin BDNF effizient in distale vesikuläre Strukturen von CA1 Pyramidenzellen organotypischer Schnittkulturen des Hippokampus sortiert wird. Die basalen elektrischen Eigenschaften von CA1 Pyramidenzellen BDNF-defizienter Mäuse sind vergleichbar zu den Eigenschaften von Wildtyp Mäusen. Sowohl das Eigenpotential der CA1 Pyramidenzellen, die Form der Aktionspotentiale als auch die evozierten Antworten der CA1 Pyramdenzellen auf eine gepaarte präsynaptische Stimulation der Schaffer-Kollateralen zeigten bei BDNF-/- -, BDNF+/- - und BDNF+/+ -Mäusen keine signifikanten Unterschiede. Die Fähigkeit der CA1 Pyramidenzellen auf eine hochfrequente Reizung mit einer Langzeitpotenzierung (LTP) der postsynaptischen Ströme zu reagieren ist jedoch bei den BDNF-defizienten Mäusen beinträchtigt. Eine verminderte Induktion von LTP war in den BDNF-defizienten Mäusen nach tetanischer Stimulation der präsynaptischen Schaffer-Kollateralen und simultaner postsynaptischer Depolarisation der CA1 Pyramidenzelle zu beobachten.