Flagellin:allergen fusion proteins as novel vaccines for the treatment of severe type I allergies

Over the last decades the prevalence of food allergies has continually increased on a world wide scale. While there are effective treatments available for bee and wasp venom allergic patients, there is currently no established therapy for the treatment of severe food allergies. Aim of the project was to genetically fuse different food allergens with the immune modulating Toll-like receptor 5 (TLR5)-ligand flagellin and to test these constructs for their immune modulatory capacities both in vitro and in vivo. Chicken ovalbumin (Ova) as model antigen, Pru p 3, and Ara h 2 the respective major allergens from peach and peanut were used as allergens. The potential vaccine candidates were characterized by protein biochemical methods (purity, folding, endotoxin contaminations). Moreover, their immune modulating effects on cell culture lines (TLR5-receptor activation) and primary mouse immune cells (myeloid and plasmacytoid dendritic cells) were investigated. Additionally, the prophylactic and therapeutic use of the flagellin Ova fusion protein (rflaA:Ova) were investigated in a mouse model of intestinal allergy. In myeloid dendritic cells (mDC) stimulation with the fusion proteins led to a strong cell activation and cytokine secretion. Here, the fusion proteins proved to be a much stronger stimulus than the equimolar amount of both proteins provided alone or as a mixture. Noteworthy, stimulation with rflaA:Ova induced the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 from mDC. In co-culture experiments this IL-10 secretion suppressed the Ova-induced secretion of Th1 and Th2 cytokines from Ova-specific CD4 T cells. Using MyD88-deficient mDC this repression of cytokine secretion was shown to be TLR-dependent. Finally, the potency of the rflaA:Ova construct was investigated in a mouse model of Ova-induced intestinal allergy. In a prophylactic vaccination approach rflaA:Ova was shown to prevent the establishment of the intestinal allergy and all associated symptoms (weight loss, temperature drop, soft faeces). This fusion protein-mediated protection was accompanied by a reduced T cell activation, and reduced Th2 cytokines in intestinal homogenates. These effects were paralleled by a strong induction of Ova-specific IgG2a antibodies in rflaA:Ova-vaccinated sera, while Ova-specific IgE antibody production was significantly reduced. Therapeutic vaccination with rflaA:Ova reduced allergic symptoms and T cell activation but did not influence weight loss and antibody production. In all in vivo experiments vaccination with both proteins either provided alone or as a mixture did not have comparable effects. Future experiments aim at elucidating the mechanism and further optimization of the therapeutic vaccination approach. The results presented in this thesis demonstrate, that fusion proteins containing flagellin have strong immune modulatory capacities both in vitro and in vivo. Therefore, such constructs are promising vaccine candidates for the therapy of type I allergies.

Immunevasive Strategien des Humanen Cytomegalovirus : Einfluss des Tegumentproteins pp71 und des Immunevasins gpUS3 auf die MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation infizierter Zellen

Bei Menschen mit unreifem oder geschwächtem Immunsystem kann eine Infektion mit dem Humanen Cytomegalovirus (HCMV) zu schweren Erkrankungen führen. Hingegen kontrolliert das Immunsystem bei Gesunden die HCMV-Infektion fast vollständig. Wichtige Effektoren hierbei sind CD8-positive zytotoxische T-Zellen (CTLs). Um dieser Kontrolle entgegenzuwirken, exprimiert HCMV die als Immunevasine bekannten Proteine gpUS2, gpUS3, gpUS6 und gpUS11. Sie greifen an unterschiedlichen Stellen in die MHC-Klasse-I (MHC-I)-vermittelte Antigenpräsentation ein und schützen so infizierte Zellen vor der Erkennung durch CTLs. Zusätzlich waren auch den Tegumentproteinen pp65 und pp71 immunevasive Funktionen zugeschrieben worden, wobei jedoch über diese Funktionen bisher nur wenig bekannt war. Daher sollte im ersten Teil der vorliegenden Arbeit die Beteiligung von pp71 an der MHC-I-Immunevasion von HCMV-infizierten humanen Fibroblasten untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden HCMV-Mutanten eingesetzt, die pp71 verstärkt exprimierten. Entgegen der postulierten immunevasiven Rolle von pp71 konnte zu keinem Zeitpunkt der Infektion ein inhibierender Effekt von pp71 auf die Antigenpräsentation infizierter Fibroblasten festgestellt werden. Sehr früh nach Infektion war sogar eine pp71-vermittelte Steigerung der Präsentation des HCMV-Proteins IE1 zu beobachten. Um zu prüfen, ob es auch während einer natürlichen Infektion zu einer Erhöhung der pp71-Expression und den damit verbundenen Effekten kommen kann, wurde untersucht, ob die Expression von pp71 durch Zellstress induzierbar ist. Dies erschien möglich, da der Leserahmen für pp71 von einer bizistronischen mRNA kodiert wird. Über die Erzeugung von Zellstress durch Serumentzug konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Expression des wichtigen viralen Transaktivators pp71 abhängig vom physiologischen Zustand der infizierten Zellen reguliert wird. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle des Immunevasins gpUS3 näher beleuchtet werden. Sein Wirkmechanismus war, wie die Mechanismen der drei anderen Immunevasine gpUS2, gpUS6 und gpUS11, bereits ausführlicher untersucht worden. Der individuelle Beitrag von gpUS3 zur MHC-I-Immunevasion in infizierten Zellen sowie ein mögliches Zusammenspiel mit den anderen Immunevasinen waren hingegen noch zu erforschen. Hierzu wurden HCMV-Mutanten eingesetzt, die keines oder nur eines der Immunevasine exprimierten. Mit ihrer Hilfe konnte gezeigt werden, dass gpUS3 sehr früh nach Infektion überraschenderweise die Immunevasion in infizierten Fibroblasten behindert. Zu späteren Infektionszeitpunkten war dagegen ein immunevasiver Effekt von gpUS3 in Form einer Kooperation mit jeweils einem der drei anderen Immunevasine festzustellen. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich die neue Hypothese, dass die Hauptaufgabe von gpUS3 im Rahmen der HCMV-Immunevasion in der Regulation der Funktionen der übrigen Immunevasine liegt.