Proteolysis of the receptor for advanced glycation end products by matrix metalloproteinases

RAGE mediates diverse physiological and pathological effects by binding a variety of ligands. Despite incomplete understanding of RAGE-mediated disorders soluble RAGE (sRAGE) has been identified as a potential biomarker for RAGE-related diseases and possibly represents a hopeful pharmaceutical against RAGE-mediated disorders. Nevertheless, the source of sRAGE remains poorly investigated. Currently sRAGE is thought to be derived exclusively from alternative splicing of mRNA. In this thesis it was investigated whether sRAGE can also be released as a result of ectodomain shedding of full-length RAGE. Using cells overexpressing RAGE as a model system, it was demonstrated clearly that RAGE undergoes ectodomain shedding in both constitutive and regulated manner. Several stimuli including PMA, AMPA, calcium and chelerythrine stimulated the release of sRAGE into cell culture medium. Moreover, possible mechanisms that regulate ectodomain shedding of RAGE were investigated and it was found that shedding of RAGE is likely independent from PKC and MAPK pathways. By using gain of function and loss of function approaches MMP9 but not ADAM10, ADAM17 or MT1-MMP was characterized as the metalloproteinase that mediates shedding of RAGE. Furthermore, it was shown that cytoplasmic domain of RAGE is not essential for shedding of RAGE. In addition, the potential cleavage site of RAGE by MMP9 was investigated and a lack of sequence specificity for the RAGE processing proteinase was demonstrated by mutation analysis. Finally the physiopathological significance of shedding of RAGE is discussed. In conclusion, for the first time ectodomain shedding of human RAGE and the underlying regulatory mechanisms were investigated. The data open a new field for modulation of RAGE shedding as a novel intervention approach against RAGE-mediated diseases.

Picard-Fuchs equations of dimensionally regulated Feynman integrals

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit besch¨aftige ich mich mit Differentialgleichungen von Feynman– Integralen. Ein Feynman–Integral h¨angt von einem Dimensionsparameter D ab und kann f¨ur ganzzahlige Dimension als projektives Integral dargestellt werden. Dies ist die sogenannte Feynman–Parameter Darstellung. In Abh¨angigkeit der Dimension kann ein solches Integral divergieren. Als Funktion in D erh¨alt man eine meromorphe Funktion auf ganz C. Ein divergentes Integral kann also durch eine Laurent–Reihe ersetzt werden und dessen Koeffizienten r¨ucken in das Zentrum des Interesses. Diese Vorgehensweise wird als dimensionale Regularisierung bezeichnet. Alle Terme einer solchen Laurent–Reihe eines Feynman–Integrals sind Perioden im Sinne von Kontsevich und Zagier. Ich beschreibe eine neue Methode zur Berechnung von Differentialgleichungen von Feynman– Integralen. ¨ Ublicherweise verwendet man hierzu die sogenannten ”integration by parts” (IBP)– Identit¨aten. Die neue Methode verwendet die Theorie der Picard–Fuchs–Differentialgleichungen. Im Falle projektiver oder quasi–projektiver Variet¨aten basiert die Berechnung einer solchen Differentialgleichung auf der sogenannten Griffiths–Dwork–Reduktion. Zun¨achst beschreibe ich die Methode f¨ur feste, ganzzahlige Dimension. Nach geeigneter Verschiebung der Dimension erh¨alt man direkt eine Periode und somit eine Picard–Fuchs–Differentialgleichung. Diese ist inhomogen, da das Integrationsgebiet einen Rand besitzt und daher nur einen relativen Zykel darstellt. Mit Hilfe von dimensionalen Rekurrenzrelationen, die auf Tarasov zur¨uckgehen, kann in einem zweiten Schritt die L¨osung in der urspr¨unglichen Dimension bestimmt werden. Ich beschreibe außerdem eine Methode, die auf der Griffiths–Dwork–Reduktion basiert, um die Differentialgleichung direkt f¨ur beliebige Dimension zu berechnen. Diese Methode ist allgemein g¨ultig und erspart Dimensionswechsel. Ein Erfolg der Methode h¨angt von der M¨oglichkeit ab, große Systeme von linearen Gleichungen zu l¨osen. Ich gebe Beispiele von Integralen von Graphen mit zwei und drei Schleifen. Tarasov gibt eine Basis von Integralen an, die Graphen mit zwei Schleifen und zwei externen Kanten bestimmen. Ich bestimme Differentialgleichungen der Integrale dieser Basis. Als wichtigstes Beispiel berechne ich die Differentialgleichung des sogenannten Sunrise–Graphen mit zwei Schleifen im allgemeinen Fall beliebiger Massen. Diese ist f¨ur spezielle Werte von D eine inhomogene Picard–Fuchs–Gleichung einer Familie elliptischer Kurven. Der Sunrise–Graph ist besonders interessant, weil eine analytische L¨osung erst mit dieser Methode gefunden werden konnte, und weil dies der einfachste Graph ist, dessen Master–Integrale nicht durch Polylogarithmen gegeben sind. Ich gebe außerdem ein Beispiel eines Graphen mit drei Schleifen. Hier taucht die Picard–Fuchs–Gleichung einer Familie von K3–Fl¨achen auf.

Signalling mechanisms affecting regulated neurotrophin secretion in hippocampal neurons

Die Neurotrophine aus Säugetiere BDNF und NT-3 sind von Neuronen sekretierte Wachstumsfaktoren. Ferner sind Neurotrophine in verschiedene Formen der aktivitätsabhängigen synaptische Plastizität involviert. Obwohl die Ausschüttung von Neurotrophine aus Synapsen beschrieben worden ist, sind die intrazellulären Signalkaskaden, die die synaptische Ausschüttung von Neurotrophine regulieren, bei weitem nicht verstanden. Deswegen ist die Analyse der Sekretion von Neurotrophine auf subzellulärer Ebene erforderlich, um die genaue Rolle von präsynaptische und postsynaptische NT-Sekretion in der synaptischen Plastizität aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kulturen von dissoziierten hippocampalen Neuronen aus Ratten mit grün fluoreszierenden Protein-markierten Konstrukten von BDNF und NT-3 transfiziert und Neurotrophine-enthaltenden Vesikeln durch die Colokalisierung mit dem cotransfizierten postsynaptischen Marker PSD-95-DsRed an glutamatergen Synapsen identifiziert. Depolarisationsinduzierte Sekretion von BDNF und NT-3 wurde per Direktaufnahme am Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die unvermittelte postsynaptische Depolarisation mit erhöhtem Kalium, in Gegenwart von Inhibitoren der synaptischen Transmission, erlaubte die Untersuchung der Signalwege, die am postsynaptischen Sekretionsprozess der Neurotrophinvesikel beteiligt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die depolarisationsinduzierte postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine durch Calcium-Einstrom ausgelöst wird, entweder über L-Typ-spannungsabhängige Calcium-Kanäle oder über NMDA-Rezeptoren. Eine anschließende Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern über Ryanodin-Rezeptoren ist für den Sekretionsprozess erforderlich. Die postsynaptische Neurotrophinausschüttung wird durch KN-62 und KN-93 gehemmt, was auf eine unmittelbare Abhängigkeit von aktiver alpha-Calcium-Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) hinweist. Der Inhibitor der cAMP/Proteinkinase A (PKA), Rp-cAMP-S, sowie der NO-Donor, SNP, minderten die Neurotrophinausschüttung. Hingegen blieben die Erhöhung des intrazellulären cAMP und der NO-Synthase-Inhibitor L-NMMA ohne Wirkung. Mit dem Trk-Inhibitor K252a konnte gezeigt werden, dass autokrine Neurotrophin-induzierte Neurotrophinausschüttung nicht an der synaptischen Freisetzung der Neurotrophine beiträgt und, dass BDNF seine eigene postsynaptische Sekretion nicht auslöst. Freisetzungsexperimente mit dem Fluoreszenz-Quencher Bromphenolblau konnten den Nachweis erbringen, dass asynchrone und anhaltende Fusionsporenöffnung von Neurotrophinvesikeln während der Sekretion stattfindet. Wegen der im Vergleich zum komplexen Sekretionsprozess schnellen Fusionsporenöffnung, scheint die Freisetzungsgeschwindigkeit von Neurotrophine durch ihre Diffusion aus dem Vesikel begrenzt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine starke Abhängigkeit der aktivitätsabhängigen postsynaptischen Neurotrophinausschüttung vom Calcium-Einstrom, von der Freisetzung von Calcium aus internen Speichern, von der Aktivierung der CaMKII und einem intakten Funktion der PKA, während der Trk-Signalweg, die Aktivierung von Natrium-Kanäle und NO-Signale nicht erforderlich sind.