Untersuchung neuer hochwirksamer neuroprotektiver Antioxidantien in experimentellen Modellen der Parkinsonschen Krankheit

Bei der Parkinsonschen Krankheit kommt es zu einer selektiven Degeneration der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra pars compacta. Die Rolle des oxidativen Stresses in der Pathogenese dieser Erkrankung konnte an post mortem Untersuchungen der Parkinson-Patienten, wie auch an zahlreichen in vitro und in vivo Modellen bestätigt werden. Die Anwendung von Antioxidantien wurde als therapeutische Strategie der Parkinsonschen Krankheit vorgeschlagen. In dieser Hinsicht wurden bereits antioxidative Substanzen in klinischen Studien evaluiert. Klinische Studien mit Antioxidantien haben jedoch bislang nur wenig überzeugende Ergebnisse erbracht, mit Ausnahme des Einsatzes des Ubichinons (Coenzym Q). Eine kritische Analyse der klinischen Studien lässt zusammenfassen, dass auf Seiten der verwendeten Antioxidantien noch massiver Optimierungsbedarf besteht. Für einen erfolgreichen therapeutischen Einsatz von Antioxidantien bei dieser Krankheit sind folgende Eigenschaften der Substanzen von höchster Bedeutung: i) maximale neuroprotektive Aktivität bei geringen Dosen; ii) geringe Nebenwirkungen; iii) eine hohe Blut-Hirn-Schrankengängigkeit.In dieser Arbeit wurde das neuroprotektive Potential von drei Bisarylimin-basierten antioxidativen Strukturen (Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin) in in vitro und in vivo Parkinson-Modellsystemen evaluiert. Beide experimentellen Modelle basieren auf der Wirkung der mitochondrialen Komplex I Inhibitoren 1-Methyl-4-Phenylpyridin (MPP+) und Rotenon, welche pathophysiologische Charakteristika der Parkinsonschen Krankheit reproduzieren. Unsere in vitro Untersuchungen an primären Neuronen des Mittelhirns und der klonalen SH-SY5Y-Neuroblastomazelllinie konnten zeigen, dass die Komplex I Inhibition krankheitsspezifische zelluläre Merkmale induziert, wie die Abnahme der antioxidativen Verteidigungskapazität und Verlust des mitochondrialen Membranpotentials. Zusätzlich kommt es in primären Neuronen des Mittelhirns zur selektiven Degeneration dopaminerger Neurone, welche in der Parkinsonschen Erkrankung besonders betroffen sind. Ko-Inkubation der in vitro Modelle mit Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin in niedrigen Konzentrationen (50 nM) halten die pathologischen Prozesse fast vollständig auf. In vivo Untersuchungen am MPP+- und Rotenon-basierten Caenorhabditis elegans (C. elegans) Modell bestätigen das neuroprotektive Potential der Bisarylimine. Hierfür wurde eine transgene C. elegans Linie mithilfe einer dopaminerg spezifischen DsRed2- (Variante des rot fluoreszierenden Proteins von Discosoma sp.)-Expression und pan-neuronaler CFP- (cyan fluoreszierendes Protein)-Expression zur Visualisierung der dopaminergen Neuronenpopulation in Kontrast zum Gesamtnervensystem erstellt. Behandlung des C. elegans mit MPP+ und Rotenon im larvalen und adulten Stadium führt zu einer selektiven Degeneration dopaminerger Neurone, sowie zum Entwicklungsarrest der larvalen Population. Die dopaminerge Neurodegeneration, wie auch weitere phänotypische Merkmale des C. elegans Modells, können durch Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin in niedrigen Konzentrationen (500 nM) komplett verhindert werden. Ein systemischer Vergleich aromatischer Bisarylimine mit bekannten, gut charakterisierten Antioxidantien, wie α-Tocopherol (Vitamin E), Epigallocatechingallat und β-Catechin, zeigt, dass effektive Konzentrationen für Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin um Zehnerpotenzen niedriger liegen im Vergleich zu natürlichen Antioxidantien. Der Wirkungsmechanismus der Bisarylimine konnte in biochemischen und in vitro Analysen, sowie in Verhaltensuntersuchungen an C. elegans von der Wirkungsweise strukturell ähnlicher, neuroleptisch wirkender Phenothiazin-Derivate differenziert werden. Die Analyse des dopaminerg-gesteuerten Verhaltens (Beweglichkeit) in C. elegans konnte verdeutlichen, dass antioxidative und Dopaminrezeptor-bindende Eigenschaften der Bisaryliminstrukturen sich gegenseitig ausschließen. Diese qualitativen Merkmale unterscheiden Bisarylimine fundamental von klinisch angewandten Neuroleptika (Phenothiazin-Derivate), welche als Dopaminrezeptor-Antagonisten zur Behandlung psychischer Erkrankungen klinisch eingesetzt werden.Aromatische Bisarylimine (Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin) besitzen günstige strukturelle Eigenschaften zur antioxidativ-basierter Neuroprotektion. Durch die Anwesenheit der antioxidativ wirkenden, nicht-substituierten Iminogruppe unterscheiden sich Bisarylimine grundlegend von neuroleptisch-wirkenden Phenothiazin-Derivaten. Wichtige strukturelle Voraussetzungen eines erfolgreichen antioxidativen Neuropharmakons, wie eine hohe Radikalisierbarkeit, die stabile Radikalform und der lipophile Charakter des aromatischen Ringsystems, werden in der Bisaryliminstruktur erfüllt. Antioxidative Bisarylimine könnten in der Therapie der Parkinsonschen Krankheit als eine effektive neuroprotektiv-therapeutische Strategie weiter entwickelt werden.

Effects of low-density lipoprotein receptor-related protein 4 and apolipoprotein E isoforms on bone metabolism in vivo

LRP4, member of the LDLR family, is a multifunctional membrane-bound receptor that is expressed in various tissues. The expression of LRP4 by osteoblasts, its novel interaction with Wnt-signaling inhibitors Dkk1 and SOST, and the lower levels of activated beta-catenin in different bone locations described here, adds another player to the long list of established factors that modulate canonical Wnt-signaling in bone. By demonstrating that in addition to Wise, LRP4 is able to interact with two additional important modulators of Wnt- and BMP-signaling, our perspective of the complexity of the integration of BMP and Wnt-signaling pathways on the osteoblast surface has expanded further. Nevertheless the recently described association of both the SOST and LRP4 genes with BMD in humans, together with our findings suggest that LRP4 plays a physiologically important role in the skeletal development and bone metabolism not only in rodents, but in humans as well. The efficiency with which LRP4 binds both SOST and Dkk1, presumably at the osteoblastic surface, LRP4 may act as a sink and competes with LRP5/6 for the binding of these Wnt antagonists, which then are no longer available for suppression of the signal through the LRP5/6 axis. rnApoE, a 299 amino acid glycoprotein, is a crucial regulator in the uptake of triglyceride, phospholipids, cholesteryl esters, and cholesterol into cells. ApoE has been linked to osteoporosis, and such a role is further strengthened by the present of a high bone mass phenotype in ApoE null mice. Until recently, the effects of respective ApoE isoforms E2, E3, and E4, and their impact on bone metabolism, have been unclear. Here we report that respective human ApoE knockin mice display diverse effects on bone metabolism. ApoE2 mice show decreased trabecular bone volume per total volume in femoral bone and lumbar spine in comparison to ApoE3 and E4 animals. In this context, urinary bone resorption marker DPD is increased in these animals, which is accompanied by a low ratio of osteoclastogenesis markers OPG/RANKL. Interestingly, serum bone formation markers ALP and OCN are diminished in ApoE4 mice. In contrast to this finding, ApoE2 mice show the lowest bone formation of all groups in vivo. These findings cannot be explained by the low receptor-affinity of ApoE2 and subsequent decreased uptake of triglyceride-rich lipoproteins by osteoblasts, resulting in elevated levels of undercarboxylated osteocalcin. Thus, other crucial pathways relevant for bone metabolism, e. g. Wnt/beta-catenin-signaling pathways, must be, compared to the ApoE3/4 isoforms, more affected by the ApoE2 isoform.

In vitro modulation of epileptiform activity in the hippocampal formation of immature rodents by GABAergic antagonists, dopamine and methylxanthines

Während des frühen Lebens stellen epileptische Anfälle schwere neurologische Zustände dar, weil sie ein großer Risikofaktor für die Manifestation der Epilepsie sind und eine hohe pharmakologische Resistenz zeigen. In meiner Doktorarbeit konzentrierte ich mich auf die Frage, wie verschiedene Neurotransmitter-Systeme und klinisch verwendete Medikamente epileptiforme Entladungen im perinatalen Hippocampus beeinflussen. rnIm ersten Teil meines Projektes untersuchte ich die Wirkung von GABA-Antagonisten und Modulatoren, die zwischen phasischen und tonischen GABAergen Strömen differenzieren, auf Feldpotentialaktivität in Hippocampusschnitten. Diese Experimente zeigten, dass im unreifen Hippocampus synaptische GABAerge Aktivität benötigt wird, um die Erregbarkeit zu begrenzen, während tonische GABAerge Ströme die Erregbarkeit verstärken können. Dies könnte darauf hinweisen, dass Antiepileptika mit einer höheren Spezifität für synaptische GABAA-Rezeptoren wirksamer zur Behandlung von epileptischen Anfällen bei Neugeborenen sein können. rnUm den Einfluss von Dopamin auf die Erregbarkeit des unreifen Hippocampus herauszufinden, untersuchte ich im zweiten Teil meiner Arbeit die Wirkung von verschiedenen Dopaminkonzentrationen und spezifische Agonisten und Antagonisten der Dopamin-Rezeptor-Subtypen auf epileptiforme Entladungen. Diese Experimente zeigten, dass niedrige Dopamin Konzentrationen eine antikonvulsive Wirkung haben, welche vom D2-ähnliche-Rezeptor-Agonisten Quinpirol nachgeahmt werden kann, während höhere Dopamin-Konzentrationen eine prokonvulsive Wirkung über Aktivierung von D1-ähnlichen Rezeptoren hervorrufen. Obwohl unsere Untersuchungen eine mögliche Verwendung von D2-ähnlichen Rezeptor-Agonisten zur Kontrolle epileptischer Anfälle in Neugeborenen nahelegen, müssen mögliche negative Auswirkungen von DAergen Agonisten und Antagonisten auf die neuronale Entwicklung berücksichtigt werden.rnIm dritten Teil meiner Arbeit untersuchte ich welche Konzentrationen von Methylxanthinen epileptische Anfälle in Hippocampuspreparationen auslösen die synaptische Übertragungen verändern können. Diese Experimente zeigten, dass sowohl Theophyllin als auch Koffein in höheren Konzentrationen die basale synaptische Übertragungen in der CA1-Region des Hippocampus modifizieren und epileptiforme Entladungen provozieren. Die Auswirkungen auf die postsynaptischen Antworten und spontanen epileptiformen Entladungen durch Koffein waren weniger ausgeprägt, was darauf hindeutet, dass diese Substanz potentiell vorteilhafter für therapeutische Anwendungen bei Frühgeborenen sein kann. rnZusammenfassend bereichern die Ergebnisse meiner Studie erheblich unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen epileptiformer Aktivität im unreifen Hippocampus und den therapeutischen Einsatz von Methylxanthinen und Pharmaka, die auf das GABAerge und DArge System einwirken.rnrn