Development of a field method to assess root parasites of woody plants - ecological analyses of the grapevine-phylloxera interaction

The development and the growth of plants is strongly affected by the interactions between roots, rootrnassociated organisms and rhizosphere communities. Methods to assess such interactions are hardly torndevelop particularly in perennial and woody plants, due to their complex root system structure and theirrntemporal change in physiology patterns. In this respect, grape root systems are not investigated veryrnwell. The aim of the present work was the development of a method to assess and predict interactionsrnat the root system of rootstocks (Vitis berlandieri x Vitis riparia) in field. To achieve this aim, grapernphylloxera (Daktulosphaira vitifoliae Fitch, Hemiptera, Aphidoidea) was used as a graperoot parasitizingrnmodel.rnTo develop the methodical approach, a longt-term trial (2006-2009) was arranged on a commercial usedrnvineyard in Geisenheim/Rheingau. All 2 to 8 weeks the top most 20 cm of soil under the foliage wallrnwere investigated and root material was extracted (n=8-10). To include temporal, spatial and cultivarrnspecific root system dynamics, the extracted root material was analyzed digitally on the morphologicalrnproperties. The grape phylloxera population was quantified and characterized visually on base of theirrnlarvalstages (oviparous, non oviparous and winged preliminary stages). Infection patches (nodosities)rnwere characterized visually as well, partly supported by digital root color analyses. Due to the knownrneffects of fungal endophytes on the vitality of grape phylloxera infested grapevines, fungal endophytesrnwere isolated from nodosity and root tissue and characterized (morphotypes) afterwards. Further abioticrnand biotic soil conditions of the vineyards were assessed. The temporal, spatial and cultivar specificrnsensitivity of single parameters were analyzed by omnibus tests (ANOVAs) and adjacent post-hoc tests.rnThe relations between different parameters were analyzed by multiple regression models.rnQuantitative parameters to assess the degeneration of nodosity, the development nodosity attachedrnroots and to differentiate between nodosities and other root swellings in field were developed. Significantrndifferences were shown between root dynamic including parameters and root dynamic ignoringrnparameters. Regarding the description of grape phylloxera population and root system dynamic, thernmethod showed a high temporal, spatial and cultivar specific sensitivity. Further, specific differencesrncould be shown in the frequency of endophyte morphotypes between root and nodosity tissue as wellrnas between cultivars. Degeneration of nodosities as well as nodosity occupation rates could be relatedrnto the calculated abundances of grape phylloxera population. Further ecological questions consideringrngrape root development (e.g. relation between moisture and root development) and grape phylloxerarnpopulation development (e.g. relation between temperature and population structure) could be answeredrnfor field conditions.rnGenerally, the presented work provides an approach to evaluate vitality of grape root systems. Thisrnapproach can be useful, considering the development of control strategies against soilborne pests inrnviticulture (e.g. grape phylloxera, Sorospheara viticola, Roesleria subterranea (Weinm.) Redhaed) as well as considering the evaluation of integrated management systems in viticulture.

Leishmania major parasites and their interaction with human macrophages

First both life stages of Leishmania major (L. major) FEBNI parasites, promastigotes as well as amastigotes, were characterized. We found that the virulence marker GP63 and cysteine peptidase b (Cpb) were higher expressed by axenic amastigotes as compared to promastigotes. In addition to the L. major FEBNI strain, we applied and successfully modified our novel in vitro method to generate axenic amastigotes of the L. major Friedlin and 5ASKH strains. Interestingly, these L. major strains needed another temperature to be transferred into amastigotes in the axenic culture system. Investigating apoptosis mechanisms in both parasite life stages of L. major FEBNI we found both ROS dependent and independent cell death mechanisms. Focusing on promastigote and amastigote interaction with pro-inflammatory (MF I) and anti-inflammatory (MF II) macrophages we found amastigotes to be more infective as compared to promastigotes. Moreover, we could demonstrate that pro-inflammatory MF I were less susceptible to infection than anti-inflammatory MF II. Finally we investigated parasite stage-specific responses of MF I + II and their defense mechanisms against L. major. Using knockdown techniques for primary human macrophages we identified a new mechanism enabling intracellular killing of promastigotes inside MF I. This mechanism depends on the antimicrobial molecule cathelicidin (LL-37).

The interaction of Leishmania major parasites with human myeloid cells and its consequence for adaptive immunity

In der vorliegenden Arbeit fokussierten wir uns auf drei verschiedene Aspekte der Leishmanien-Infektion. Wir charakterisierten den Prozess des Zelltods „Apoptose“ bei Parasiten (1), untersuchten die Eignung von Makrophagen und dendritischen Zellen als Wirtszelle für die Entwicklung der Parasiten (2) und analysierten die Konsequenzen der Infektion für die Entstehung einer adaptiven Immunantwort im humanen System. Von zentraler Bedeutung für dieses Projekt war die Hypothese, dass apoptotische Leishmanien den Autophagie-Mechanismus ihrer Wirtszellen ausnutzen, um eine T-Zell-vermittelte Abtötung der Parasiten zu vermindern.rnWir definierten eine apoptotische Leishmanien-Population, welche durch eine rundliche Morphologie und die Expression von Phosphatidylserin auf der Parasitenoberfläche charakterisiert war. Die apoptotischen Parasiten befanden sich zudem in der SubG1-Phase und wiesen weniger und fragmentierte DNA auf, welche durch TUNEL-Assay nachgewiesen werden konnte. Bei der Interaktion der Parasiten mit humanen Makrophagen und dendritischen Zellen zeigte sich, dass die anti-inflammatorischen Makrophagen anfälliger für Infektionen waren als die pro-inflammatorischen Makrophagen oder die dendritischen Zellen. Interessanterweise wurde in den dendritischen Zellen jedoch die effektivste Umwandlung zur krankheitsauslösenden, amastigoten Lebensform beobachtet. Da sowohl Makrophagen als auch dendritische Zellen zu den antigenpräsentierenden Zellen gehören, könnte dies zur Aktivierung der T-Zellen des adaptiven Immunsystems führen. Tatsächlich konnte während der Leishmanien-Infektion die Proliferation von T-Zellen beobachtet werden. Dabei stellten wir fest, dass es sich bei den proliferierenden T-Zellen um CD3+CD4+ T-Zellen handelte, welche sich überraschenderweise als Leishmanien-spezifische CD45RO+ T-Gedächtniszellen herausstellten. Dies war unerwartet, da ein vorheriger Kontakt der Spender mit Leishmanien als unwahrscheinlich gilt. In Gegenwart von apoptotischen Parasiten konnte eine signifikant schwächere T-Zell-Proliferation in Makrophagen, jedoch nicht in dendritischen Zellen beobachtet werden. Da sich die T-Zell-Proliferation negativ auf das Überleben der Parasiten auswirkt, konnten die niedrigsten Überlebensraten in dendritischen Zellen vorgefunden werden. Innerhalb der Zellen befanden sich die Parasiten in beiden Zelltypen im Phagosom, welches allerdings nur in Makrophagen den Autophagie-Marker LC3 aufwies. Chemische Induktion von Autophagie führte, ebenso wie die Anwesenheit von apoptotischen Parasiten, zu einer stark reduzierten T-Zell-Proliferation und dementsprechend zu einem höheren Überleben der Parasiten.rnZusammenfassend lässt sich aus unseren Daten schließen, dass Apoptose in Einzellern vorkommt. Während der Infektion können sowohl Makrophagen, als auch dendritische Zellen mit Leishmanien infiziert und das adaptive Immunsystem aktivert werden. Die eingeleitete T-Zell-Proliferation nach Infektion von Makrophagen ist in Gegenwart von apoptotischen Parasiten reduziert, weshalb sie im Vergleich zu dendritischen Zellen die geeigneteren Wirtszellen für Leishmanien darstellen. Dafür missbrauchen die Parasiten den Autophagie-Mechanismus der Makrophagen als Fluchtstrategie um das adaptive Immunsystem zu umgehen und somit das Überleben der Gesamtpopulation zu sichern. Diese Ergebnisse erklären den Vorteil von Apoptose in Einzellern und verdeutlichen, dass der Autophagie-Mechanismus als potentielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von Leishmaniose dienen kann.rn