Cholesterin-Interaktion mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und intrazelluläre Verteilung

ZusammenfassungIn dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben dem Oxytocinrezeptor auch die anderen Rezeptoren der Familie der Neurohypophysenhormone, die Vasopressinrezeptoren, in der gleichen Weise in ihren Bindungseigenschaften von Cholesterin beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu zeigt der Cholecystokininrezeptor Typ B keine direkte Wechselwirkung mit Cholesterin. Durch Austausch der Transmembranhelices 6 und 7 des Oxytocinrezeptors mit entsprechenden Bereichen des Cholecystokininrezeptors wurde ein Rezeptor erzeugt, der bezüglich Bindungsverhalten und Cholesterinabhängigkeit keine Unterschiede zu dem Wildtyp-Oxytocinrezeptor zeigte. Durch den Einsatz von computergestütztem 'Modeling' wurde für die Interaktion des Oxytocinrezeptors mit Cholesterin eine Stelle zwischen den Transmembranhelices 5 und 6 vorgeschlagen. Um die Verteilung des Cholesterins in der Zelle zu untersuchen, wurde ein selbst synthetisiertes, fluoreszierendes Cholesterinderivat (Fluochol) eingesetzt. Die Komplexierung in Cyclodextrinen ermöglichte die Einlagerung von Fluochol in die Plasmamembran von Zellen. Der Einstrom des Fluochol in das ER erfolgte innerhalb von Minuten und war energieunabhängig. Schließlich wurde Fluochol in Lipidtröpfchen transportiert, die in fast allen Zellen für die Speicherung überschüssiger intrazellulärer Lipide dienen. Die Tröpfchen werden aus dem endoplasmatischen Retikulum gebildet und enthalten neben Phospholipiden auch Cholesterin, das durch das Enzym ACAT mit langkettigen Fettsäuren verestert wird.

Systematic studies of protein immobilization by surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy

The research interest of this study is to investigate surface immobilization strategies for proteins and other biomolecules by the surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) technique. The recrystallization features of the S-layer proteins and the possibility of combining the S-layer lattice arrays with other functional molecules make this protein a prime candidate for supramolecular architectures. The recrystallization behavior on gold or on the secondary cell wall polymer (SCWP) was recorded by SPR. The optical thicknesses and surface densities for different protein layers were calculated. In DNA hybridization tests performed in order to discriminate different mismatches, recombinant S-layer-streptavidin fusion protein matrices showed their potential for new microarrays. Moreover, SCWPs coated gold chips, covered with a controlled and oriented assembly of S-layer fusion proteins, represent an even more sensitive fluorescence testing platform. Additionally, S-layer fusion proteins as the matrix for LHCII immobilization strongly demonstrate superiority over routine approaches, proving the possibility of utilizing them as a new strategy for biomolecular coupling. In the study of the SPFS hCG immunoassay, the biophysical and immunological characteristics of this glycoprotein hormone were presented first. After the investigation of the effect of the biotin thiol dilution on the coupling efficiently, the interfacial binding model including the appropriate binary SAM structure and the versatile streptavidin-biotin interaction was chosen as the basic supramolecular architecture for the fabrication of a SPFS-based immunoassay. Next, the affinity characteristics between different antibodies and hCG were measured via an equilibrium binding analysis, which is the first example for the titration of such a high affinity interaction by SPFS. The results agree very well with the constants derived from the literature. Finally, a sandwich assay and a competitive assay were selected as templates for SPFS-based hCG detection, and an excellent LOD of 0.15 mIU/ml was attained via the “one step” sandwich method. Such high sensitivity not only fulfills clinical requirements, but is also better than most other biosensors. Fully understanding how LHCII complexes transfer the sunlight energy directionally and efficiently to the reaction center is potentially useful for constructing biomimetic devices as solar cells. After the introduction of the structural and the spectroscopic features of LHCII, different surface immobilization strategies of LHCII were summarized next. Among them the strategy based on the His-tag and the immobilized metal (ion) affinity chromatography (IMAC) technique were of great interest and resulted in different kinds of home-fabricated His-tag chelating chips. Their substantial protein coupling capacity, maintenance of high biological activity and a remarkably repeatable binding ability on the same chip after regeneration was demonstrated. Moreover, different parameters related to the stability of surface coupled reconstituted complexes, including sucrose, detergent, lipid, oligomerization, temperature and circulation rate, were evaluated in order to standardize the most effective immobilization conditions. In addition, partial lipid bilayers obtained from LHCII contained proteo-liposomes fusion on the surface were observed by the QCM technique. Finally, the inter-complex energy transfer between neighboring LHCIIs on a gold protected silver surface by excitation with a blue laser (λ = 473nm) was recorded for the first time, and the factors influencing the energy transfer efficiency were evaluated.

Oligomerization and protein-protein interactions of the sensory histidine kinase DcuS in Escherichia coli

DcuS is a membrane-integral sensory histidine kinase involved in the DcuSR two-component regulatory system in Escherichia coli by regulating the gene expression of C4-dicarboxylate metabolism in response to external stimuli. How DcuS mediates the signal transduction across the membrane remains little understood. This study focused on the oligomerization and protein-protein interactions of DcuS by using quantitative Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) spectroscopy. A quantitative FRET analysis for fluorescence spectroscopy has been developed in this study, consisting of three steps: (1) flexible background subtraction to yield background-free spectra, (2) a FRET quantification method to determine FRET efficiency (E) and donor fraction (fD = [donor] / ([donor]+[acceptor])) from the spectra, and (3) a model to determine the degree of oligomerization (interaction stoichiometry) in the protein complexes based on E vs. fD. The accuracy and applicability of this analysis was validated by theoretical simulations and experimental systems. These three steps were integrated into a computer procedure as an automatic quantitative FRET analysis which is easy, fast, and allows high-throughout to quantify FRET accurately and robustly, even in living cells. This method was subsequently applied to investigate oligomerization and protein-protein interactions, in particular in living cells. Cyan (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP), two spectral variants of green fluorescent protein, were used as a donor-acceptor pair for in vivo measurements. Based on CFP- and YFP-fusions of non-interacting membrane proteins in the cell membrane, a minor FRET signal (E = 0.06 ± 0.01) can be regarded as an estimate of direct interaction between CFP and YFP moieties of fusion proteins co-localized in the cell membrane (false-positive). To confirm if the FRET occurrence is specific to the interaction of the investigated proteins, their FRET efficiency should be clearly above E = 0.06. The oligomeric state of DcuS was examined both in vivo (CFP/YFP) and in vitro (two different donor-acceptor pairs of organic dyes) by three independent experimental systems. The consistent occurrence of FRET in vitro and in vivo provides the evidence for the homo-dimerization of DcuS as full-length protein for the first time. Moreover, novel interactions (hetero-complexes) between DcuS and its functionally related proteins, citrate-specific sensor kinase CitA and aerobic dicarboxylate transporter DctA respectively, have been identified for the first time by intermolecular FRET in vivo. This analysis can be widely applied as a robust method to determine the interaction stoichiometry of protein complexes for other proteins of interest labeled with adequate fluorophores in vitro or in vivo.

Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn