Integrative Musterbildung kranialer Strukturen

Form und Gestalt kraniofazialer Strukturen sind primär beeinflusst durch die inhärente Integration der unterschiedlichsten Funktionssysteme und externer selektiver Einflüsse. Die Variabilität der Schädel-Morphe ist ein Indikator für solche Einflussfaktoren und damit ein idealer Gegenstand für vergleichende Analysen morphogenetischer Formbildung. Zur Ermittlung morphologisch-adaptiver Trends und Muster wurden sowohl Hypothesen zur morphologischen Differenziertheit als auch zu Korrelationen zwischen modularen Schädelkompartimenten (fazial, neurokranial, basikranial) untersucht. Zusätzlich wurden aus Schichtröntgenaufnahmen (CT) virtuelle Modelle rekonstruiert, welche die Interpretation der statistischen Befunde unterstützen sollten. Zur Berechnung der Gestaltunterschiede wurden mittels eines mechanischen Gelenkarm-Messgerätes (MicroScribe-G2) max. 85 ektokraniale Messpunkte (Landmarks) bzw. dreidimensionale Koordinaten an ca. 520 Schädeln von fünf rezenten Gattungen der Überfamilie Hominoidea (Hylobates, Pongo, Gorilla, Pan und Homo) akquiriert. Aus dem Datensatz wurden geometrische Störfaktoren (Größe, Translation, Rotation) mathematisch eliminiert und die verbleibenden Residuale bzw. ‚Gestalt-Variablen‘ diversen multivariat-statistischen Verfahren unterzogen (Faktoren, Cluster-, Regressions- und Korrelationsanalysen sowie statistische Tests). Die angewandten Methoden erhalten die geometrische Information der Untersuchungsobjekte über alle Analyseschritte hinweg und werden unter der Bezeichnung „Geometric Morphometrics (GMM)“ als aktueller Ansatz der Morphometrie zusammengefasst. Für die unterschiedlichen Fragestellungen wurden spezifische Datensätze generiert. Es konnten diverse morphologische Trends und adaptive Muster mit Hilfe der Synthese statistischer Methoden und computer-basierter Rekonstruktionen aus den generierten Datensätzen ermittelt werden. Außerdem war es möglich, präzise zu rekonstruieren, welche kranialen Strukturen innerhalb der Stichprobe miteinander wechselwirken, einzigartige Variabilitäten repräsentieren oder eher homogen gestaltet sind. Die vorliegenden Befunde lassen erkennen, dass Fazial- und Neurokranium am stärksten miteinander korrelieren, während das Basikranium geringe Abhängigkeiten in Bezug auf Gesichts- oder Hirnschädelveränderungen zeigte. Das Basikranium erweist sich zudem bei den nicht-menschlichen Hominoidea und über alle Analysen hinweg als konservative und evolutiv-persistente Struktur mit dem geringsten Veränderungs-Potential. Juvenile Individuen zeigen eine hohe Affinität zueinander und zu Formen mit einem kleinem Gesichts- und großem Hirnschädel. Während das Kranium des rezenten Menschen primär von Enkephalisation und fazialer Retraktion (Orthognathisierung) dominiert ist und somit eine einzigartige Gestalt aufweist, zeigt sich der Kauapparat als maßgeblich formbildendes Kompartiment bei den nicht-menschlichen Formen. Die Verbindung von GMM mit den interaktiven Möglichkeiten computergenerierter Modelle erwies sich als valides Werkzeug zur Erfassung der aufgeworfenen Fragestellungen. Die Interpretation der Befunde ist durch massive Interkorrelationen der untersuchten Strukturen und der statistisch-mathematischen Prozeduren als hoch komplex zu kennzeichnen. Die Studie präsentiert einen innovativen Ansatz der modernen Morphometrie, welcher für zukünftige Untersuchungen im Bereich der kraniofazialen Gestaltanalyse ausgebaut werden könnte. Dabei verspricht die Verknüpfung mit ‚klassischen’ und modernen Zugängen (z. B. Molekularbiologie) gesteigerte Erkenntnismöglichkeiten für künftige morphometrische Fragestellungen.

Immunologische Effekte von nativen Allergenen im Vergleich zu modifizierten Allergenen

Die Prävalenz allergischer Erkrankungen ist in den letzten Jahrzehnten, insbesondere in den Industriestaaten, stetig angestiegen und schreitet weiterhin fort. Die einzige kausale Therapie, die eine Langzeitwirkung verspricht und der Entwicklung neuer Allergien bzw. dem Fortschreiten der Allergie vorbeugen kann, ist die spezifische Immuntherapie (SIT). Da bei der SIT mit natürlichen Allergenextrakten Nebenwirkungen auftreten können, ist es wichtig Alternativen für diese zu finden. In der vorliegenden Arbeit wurden native Allergene mit modifizierten Allergenen hinsichtlich ihrer Allergenität und Immunogenität verglichen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Glutaraldehyd-modifizierte Allergoide im Vergleich zu nativen Allergenextrakten und Formaldehyd-Allergoiden eine verminderte Allergenität besitzen, was sich z.B. durch den verminderten Release der Allergiemediatoren, den Leukotrienen, durch Basophile allergischer Spender zeigte. Gleichzeitig war allerdings die Fähigkeit Glutaraldehyd-Allergoid-behandelter dendritischer Zellen (DC) autologe CD4+ T-Zellen zu stimulieren stark reduziert. Verglichen mit den nativen Allergenextrakten und den Formaldehyd-Allergoiden waren die Zytokinproduktion und die T-Zellproliferation, für letztere signifikant, vermindert. Damit übereinstimmend war die Aufnahme von Fluoreszenz-markierten Glutaraldehyd-Allergoiden in unreife DC reduziert. Daraus lässt sich schießen, dass die Modifizierung mit Glutaraldehyd, jedoch nicht mit Formaldehyd, zumindest bei den hier verwendeten Allergenpräparaten, B-Zell-Epitope zerstört und somit die Allergenität herabgesetzt wurde. Allerdings war dabei gleichzeitig die Immunogenität vermindert. Das verminderte Vorkommen der B-Zell-Epitope wäre beim Einsatz der Allergoide von Vorteil, da damit eine verminderte IgE-Bindekapazität einhergeht und unerwünschte Nebenwirkungen reduziert werden können. Jedoch sollte im günstigsten Fall bei der Allergoidisierung die T-Zell-Stimulationsfähigkeit intakt bleiben, was bei den hier verwendeten Glutaraldehyd-modifizierten Allergoiden nicht der Fall war. rnMit Einzelallergenen aus Birken- und Gräserpollen konnten keine vergleichbaren T-Zellantworten erzielt werden wie mit den Gesamtallergenextrakten. Auch hier waren Proliferation und Zytokinproduktion durch CD4+ T-Zellen nach Stimulation mit Einzelallergen-gepulsten DC bei Verwendung von Glutaraldehyd-modifizierten Allergoiden vermindert. rnEine adjuvante Wirkung von Aluminiumhydroxid (Alum) in vitro konnte in dieser Arbeit nicht eindeutig gezeigt werden. Zunächst konnte beobachtet werden, dass die eingesetzten Alum-adsorbierten Allergene und Allergoide eine toxische Wirkung auf DC hatten. Die Proliferation CD4+ T-Zellen konnte durch DC, die mit Alum-adsorbierten Allergenen behandelt wurden, nicht verstärkt werden, verglichen mit DC, die mit unadsorbiertem Allergen gepulst wurden. Es konnte lediglich eine erhöhte Produktion des Th2 Zytokins IL-4 durch Alum induziert werden. Einen Adjuvanteffekt, der in Zusammenhang mit der Induktion des pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β stehen soll, konnte mittels ELISA in den Überständen unreifer DC nicht nachgewiesen werden. Lediglich in Monozyten, die zusätzlich mit dem TLR-Ligand LPS stimuliert wurden, war IL-1β in den Überständen detektierbar. Auf mRNA-Ebene konnte man einen leichten Effekt durch Alum hinsichtlich der IL-1β Expression erkennen. Nach zusätzlicher Gabe verschiedener Alum-Präparationen zu unreifen DC, die mit Allergen oder LPS stimuliert wurden, exprimierten diese leicht verstärkt IL-1β verglichen mit DC, die kein Alum erhielten.

Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells

RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat großes Potential für den Einsatz in der Therapie. Obwohl effiziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die großen Hürden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integritätsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3’- bzw. -5’-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verhältnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassifizierung des Integritätslevels einer siRNA Probe (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der Küvette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung für in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und ermöglichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares für die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschließende Evaluierung der RNase-Protektion ergab für Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse können diese und andere Transportsysteme nun für eine zelluläre Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften für Echtzeit-Integritätsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler “Cross-Talk” ermöglichten es, transfizierte Zellen über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anfängliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate für den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum für diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und Änderungen in der zellulären Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrität zurück.rn