Escherichia coli alpha-Hämolysin: Untersuchungen zur Struktur und Porenbildung

Escherichia coli α-Hämolysin (HlyA) ist ein Prototyp der RTX-Toxine, die zu den α-porenbildenden Toxinen gehören. HlyA bildet Poren in einer Vielzahl eukaryontischer Zielzellen. Das 107 kDa große Protein besteht aus 1024 Aminosäuren, die gemeinsam mit den Proteinen für posttranslationale Modifikation und Sekretion in einem Operon codiert werden. Die N-terminale Hälfte von HlyA besteht aus mehreren amphipathischen α –Helices, die mit der Porenbildung assoziiert werden, gefolgt von der Calcium-bindenden RTX-Domäne in der C-terminalen Hälfte des Moleküls. Über den porenbildenen Mechanismus ist wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit fokussierte sich auf die Frage, ob dieser Prozess eine Oligomerisierung mehrerer HlyA-Moleküle beinhaltet, oder ob die membranschädigende Struktur von einem Monomer gebildet wird. Drei unabhängige biochemische Methoden wurden in dem Versuch eingesetzt, HlyA-Oligomere in permeabilisierten Membranen zu detektieren. In allen drei Ansätzen wurden negative Ergebnisse erreicht, was das Konzept bestätigt, dass die Pore von HlyA von einem Monomer gebildet wird. PCR-basierte Cysteinsubstitutionen wurden durchgeführt, um den N-terminus von HlyA zu charakterisieren. Einzelne Cysteinreste wurden an 21 Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz 13-55 eingeführt, und mit dem umgebungssensitiven Fluorophor Badan markiert. Spektrofluorimetrische Messungen zeigten, dass alle untersuchten Aminosäuren innerhalb dieser Domäne unabhängig von der porenbildenden Aktivität in die Membran inserieren. Deletionen der Aminosäuren 1-50 hatten keinen Einfluß auf die lytische Aktivität, während die Deletion der Aminosäuren 1-100 in einer fast vollständig inaktiven Toxinmutante resultierte. Die Einführung von Prolinen durch PCR-basierte Mutagenese wurde durchgeführt, um die Beteiligung vorhergesagter α-Helices innerhalb der N-terminalen Hälfte von HlyA an der hämolytischen Aktivität zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Struktur von mindestens vier vorhergesagten Helices bedeutend für die hämolytische Aktivität ist.

Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Vibrio cholerae Cytolysins

Vibrio cholerae Cytolysin (VCC) gehört zur Gruppe der Exotoxine und bildet auf Membranen heptamere transmembrane Poren. VCC wird als protoxin mit einem Molekulargewicht von 79 kDa sezerniert und benötigt die proteolytische Spaltung der N-terminalen Pro-Region um Poren in der Membran zu bilden. Diese Spaltung erfolgt sowohl in Lösung, als auch nach der Bindung an Membranen, aber nur aktiviertes VCC oligomererisiert in eine lytische Pore. Die Kristallstruktur von VCC zeigt, dass das Monomer vier verschiedenen strukturellen Domänen enthält; die cytolytische Domäne, mit der Pre-Stem-Sequenz, der Pro-Region und den beiden C-terminalen Domänen β-Trefoil und β-Prism. Die porenbildende β-Barrel wird aus je einer Pre-Stem Domäne jedes der einzelnen sieben Untereinheiten gebildet. Da sich die porenbildende Region im Monomer zwischen den Domänen β-Prism und β-Trefoil befindet, sind konformationelle Änderungen des Toxins notwendig, um die Insertion dieser Region in die Membran zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurde unter anderem der Mechanismus der Porenbildung durch die Konstruktion von Disulfid-Derivaten untersucht. Die Bildung von Disulfidbrücken wurde verwendet, um die porenbildende Region entweder mit der β-Trefoil oder β-Prism Domäne zu verknüpfen. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen bindet das Toxin an Membranen und oligomerisiert zu SDS-labilen Oligomeren. Nach der Reduktion der künstlichen Disulfidbrücke erlangen die gebildeten Oligomere SDS-Stabilität und permeabilisieren die Membran. Durch die Zugabe steigender Konzentrationen des VCC-Derivats zu aktivem Toxin, wird die SDS-Stabilität der gebildeten Oligomere stark reduziert. Die Insertion des aktiven Toxins in die Membran wird allerdings nicht verhindert und daher Poren mit reduziertem funktionellen Durchmesser gebildet. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Bildung einer Prä-Pore vor der Insertion des Toxins in die Membran erfolgt und zeigt zum ersten Mal ein solches Zwischenstadium für ein β-porenbildendes Toxin, das von Gram-negativen Organismen produziert wird. Diese Ergebnisse deuten auf einen archetypischen Mechanismus der Porenbildung hin. Zusätzlich wurde die Funktion der beiden C-terminalen Domänen untersucht, und daher verschiedene Deletions- und Substitutionsmutanten konstruiert. Die β-Trefoil Domäne ist nicht essentiell für die Bindung des Toxins an Membranen, ist aber für die korrekte Faltung des Toxins notwendig. Die C-terminale β-Prism Domäne vermittelt die Bindung des Toxins an Membranen über Zuckerrezeptoren.

Induktion von Pro-Autophagie-Signalen durch einen extra- oder intrazellulären Alpha-Toxin-Angriff

Autophagie ist ein konservierter, kataboler Mechanismus in allen eukaryoten Zellen. Unter anderem wird ihm eine wichtige Rolle als zellautonomer Abwehrmechanismus gegen Mikroorganismen zugeschrieben; von manchen Infektionserregern wird er jedoch unterlaufen oder sogar genutzt. Der stärkste Auslöser der Autophagie ist ein Mangel an Nährstoffen, insbesondere Aminosäuren. Über die Deaktivierung der Kinase mTORC1 und die Phosphorylierung des eukaryoten Translationsinitiationsfaktors eIF2α hemmt die Nährstoffknappheit die Proteinbiosynthese und aktiviert gleichzeitig Autophagie. Wie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Autophagie auslösen oder manipulieren, ist derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Modifikationen an Mikroben oder Phagosomen und Adapterproteine, die diese Veränderungen und Komponenten des Autophagieapparates erkennen, scheinen jedenfalls bei der selektiven Erkennung durch die Autophagie-Maschinerie wichtig zu sein. rnIn der vorliegenden Dissertationsarbeit wird die Rolle des membranporenbildenden α-Toxins von Staphylococcus aureus für die Induktion von Autophagie beleuchtet. Zum einen erwies sich die Akkumulation von (EGFP)-LC3(II), einem Marker der Autophagosomen, um intrazelluläre S. aureus als abhängig von α-Toxin. Zweitens, genügt extrazellulär appliziertes α-Toxin um (EGFP)-LC3(II)-positive Endosomen zu induzieren. Während der Angriff aus dem extrazellulären Raum jedoch binnen kurzer Zeit eine fokale Kumulation von phosphoryliertem eIF2α an der Plasmamembran induziert, die an der Internalisierung des Toxins beteiligt ist, findet sich am phagosomalen Kompartiment keine Toxin-abhängige Anhäufung von p-eIF2α oder proximalen Autophagieregulatoren. Dies impliziert, dass Toxin-Angriff auf die Plasmamembran, nicht aber auf das Phagosom, zu einer Reaktion führt, wie sie bei massivem Nährstoffmangel zu beobachten ist. Obwohl keine α-Toxin-abhängige Kumulation von p-eIF2α bei einem Angriff aus dem Phagosom erfolgt, findet sich um α-Toxin-produzierende Bakterien eine massive Kumulation von LC3 und Adapterprotein p62/Sequestosome1. Dies deutet daraufhin, dass der Ort des Angriffs - Plasmamembran oder Phagosom – für den Autophagie-induzierenden Mechanismus wichtig sein könnte. Der unterschiedliche Effekt auf die zellulären Ionenkonzentrationen, den ein Angriff auf die Plasmamembran oder auf ein Phagosom auslösen würde, bietet hierfür eine mögliche Erklärung. Die Aktivierung der Autophagie über Adapterproteine könnte dann als back-up Mechanismus fungieren, der auch dann greift, wenn eine Invasion ohne Schädigung der Plasmamembran erfolgt. Ein cross-talk der beiden Induktionswege ist angesichts der Bedeutung von p62 für die selektive und die Hunger-assoziierte Autophagie gut möglich; sezerniertes Toxin könnte durch die Aktivierung der basalen Autophagie Adapter-basierte Mechanismen verstärken.

Pore structure and column efficiency of silica monoliths in high performance liquid chromatography (HPLC)

Five different methods were critically examined to characterize the pore structure of the silica monoliths. The mesopore characterization was performed using: a) the classical BJH method of nitrogen sorption data, which showed overestimated values in the mesopore distribution and was improved by using the NLDFT method, b) the ISEC method implementing the PPM and PNM models, which were especially developed for monolithic silicas, that contrary to the particulate supports, demonstrate the two inflection points in the ISEC curve, enabling the calculation of pore connectivity, a measure for the mass transfer kinetics in the mesopore network, c) the mercury porosimetry using a new recommended mercury contact angle values. rnThe results of the characterization of mesopores of monolithic silica columns by the three methods indicated that all methods were useful with respect to the pore size distribution by volume, but only the ISEC method with implemented PPM and PNM models gave the average pore size and distribution based on the number average and the pore connectivity values.rnThe characterization of the flow-through pore was performed by two different methods: a) the mercury porosimetry, which was used not only for average flow-through pore value estimation, but also the assessment of entrapment. It was found that the mass transfer from the flow-through pores to mesopores was not hindered in case of small sized flow-through pores with a narrow distribution, b) the liquid penetration where the average flow-through pore values were obtained via existing equations and improved by the additional methods developed according to Hagen-Poiseuille rules. The result was that not the flow-through pore size influences the column bock pressure, but the surface area to volume ratio of silica skeleton is most decisive. Thus the monolith with lowest ratio values will be the most permeable. rnThe flow-through pore characterization results obtained by mercury porosimetry and liquid permeability were compared with the ones from imaging and image analysis. All named methods enable a reliable characterization of the flow-through pore diameters for the monolithic silica columns, but special care should be taken about the chosen theoretical model.rnThe measured pore characterization parameters were then linked with the mass transfer properties of monolithic silica columns. As indicated by the ISEC results, no restrictions in mass transfer resistance were noticed in mesopores due to their high connectivity. The mercury porosimetry results also gave evidence that no restrictions occur for mass transfer from flow-through pores to mesopores in the small scaled silica monoliths with narrow distribution. rnThe prediction of the optimum regimes of the pore structural parameters for the given target parameters in HPLC separations was performed. It was found that a low mass transfer resistance in the mesopore volume is achieved when the nominal diameter of the number average size distribution of the mesopores is appr. an order of magnitude larger that the molecular radius of the analyte. The effective diffusion coefficient of an analyte molecule in the mesopore volume is strongly dependent on the value of the nominal pore diameter of the number averaged pore size distribution. The mesopore size has to be adapted to the molecular size of the analyte, in particular for peptides and proteins. rnThe study on flow-through pores of silica monoliths demonstrated that the surface to volume of the skeletons ratio and external porosity are decisive for the column efficiency. The latter is independent from the flow-through pore diameter. The flow-through pore characteristics by direct and indirect approaches were assessed and theoretical column efficiency curves were derived. The study showed that next to the surface to volume ratio, the total porosity and its distribution of the flow-through pores and mesopores have a substantial effect on the column plate number, especially as the extent of adsorption increases. The column efficiency is increasing with decreasing flow through pore diameter, decreasing with external porosity, and increasing with total porosity. Though this tendency has a limit due to heterogeneity of the studied monolithic samples. We found that the maximum efficiency of the studied monolithic research columns could be reached at a skeleton diameter of ~ 0.5 µm. Furthermore when the intention is to maximize the column efficiency, more homogeneous monoliths should be prepared.rn

Elastizität porenüberspannender Membranen: eine kraftmikroskopische Studie

Membranen spielen eine essentielle Rolle bei vielen wichtigen zellulären Prozessen. Sie ermöglichen die Erzeugung von chemischen Gradienten zwischen dem Zellinneren und der Umgebung. Die Zellmembran übernimmt wesentliche Aufgaben bei der intra- und extrazellulären Signalweiterleitung und der Adhäsion an Oberflächen. Durch Prozesse wie Endozytose und Exozytose werden Stoffe in oder aus der Zelle transportiert, eingehüllt in Vesikel, welche aus der Zellmembran geformt werden. Zusätzlich bietet sie auch Schutz für das Zellinnere. Der Hauptbestandteil einer Zellmembran ist die Lipiddoppelschicht, eine zweidimensionale fluide Matrix mit einer heterogenen Zusammensetzung aus unterschiedlichen Lipiden. In dieser Matrix befinden sich weitere Bausteine, wie z.B. Proteine. An der Innenseite der Zelle ist die Membran über Ankerproteine an das Zytoskelett gekoppelt. Dieses Polymernetzwerk erhöht unter anderem die Stabilität, beeinflusst die Form der Zelle und übernimmt Funktionenrnbei der Zellbewegung. Zellmembranen sind keine homogenen Strukturen, je nach Funktion sind unterschiedliche Lipide und Proteine in mikrsokopischen Domänen angereichert.Um die grundlegenden mechanischen Eigenschaften der Zellmembran zu verstehen wurde im Rahmen dieser Arbeit das Modellsystem der porenüberspannenden Membranen verwendet.Die Entwicklung der porenüberspannenden Membranen ermöglicht die Untersuchung von mechanischen Eigenschaften von Membranen im mikro- bis nanoskopischen Bereich mit rasterkraftmikroskopischen Methoden. Hierbei bestimmen Porosität und Porengröße des Substrates die räumliche Auflösung, mit welcher die mechanischen Parameter untersucht werdenrnkönnen. Porenüberspannende Lipiddoppelschichten und Zellmembranen auf neuartigen porösen Siliziumsubstraten mit Porenradien von 225 nm bis 600 nm und Porositäten bis zu 30% wurden untersucht. Es wird ein Weg zu einer umfassenden theoretischen Modellierung der lokalen Indentationsexperimente und der Bestimmung der dominierenden energetischen Beiträge in der Mechanik von porenüberspannenden Membranen aufgezeigt. Porenüberspannende Membranen zeigen eine linear ansteigende Kraft mit zunehmender Indentationstiefe. Durch Untersuchung verschiedener Oberflächen, Porengrößen und Membranen unterschiedlicher Zusammensetzung war es für freistehende Lipiddoppelschichten möglich, den Einfluss der Oberflächeneigenschaften und Geometrie des Substrates, sowie der Membranphase und des Lösungsmittels auf die mechanischen Eigenschaften zu bestimmen. Es ist möglich, die experimentellen Daten mit einem theoretischen Modell zu beschreiben. Hierbei werden Parameter wie die laterale Spannung und das Biegemodul der Membran bestimmt. In Abhängigkeit der Substrateigenschaften wurden für freitragende Lipiddoppelschichten laterale Spannungen von 150 μN/m bis zu 31 mN/m gefunden für Biegemodulde zwischen 10^(−19) J bis 10^(−18) J. Durch Kraft-Indentations-Experimente an porenüberspannenden Zellmembranen wurde ein Vergleich zwischen dem Modell der freistehenden Lipiddoppelschichten und nativen Membranen herbeigeführt. Die lateralen Spannungen für native freitragende Membranen wurden zu 50 μN/m bestimmt. Weiterhin konnte der Einfluss des Zytoskeletts und der extrazellulä-rnren Matrix auf die mechanischen Eigenschaften bestimmt und innerhalb eines basolateralen Zellmembranfragments kartiert werden, wobei die Periodizität und der Porendurchmesser des Substrates das räumliche Auflösungsvermögen bestimmen. Durch Fixierung der freistehenden Zellmembran wurde das Biegemodul der Membran um bis zu einem Faktor 10 erhöht. Diese Arbeit zeigt wie lokal aufgelöste, mechanische Eigenschaften mittels des Modellsystems der porenüberspannenden Membranen gemessen und quantifiziert werden können. Weiterhin werden die dominierenden energetischen Einflüsse diskutiert, und eine Vergleichbarkeit zurnnatürlichen Membranen hergestellt.rn

Forward modelling of petrological crust-forming processes on the early Earth

Tonalite-trondhjemite-granodiorite (TTG) gneisses form up to two-thirds of the preserved Archean continental crust and there is considerable debate regarding the primary magmatic processes of the generation of these rocks. The popular theories indicate that these rocks were formed by partial melting of basaltic oceanic crust which was previously metamorphosed to garnet-amphibolite and/or eclogite facies conditions either at the base of thick oceanic crust or by subduction processes.rnThis study investigates a new aspect regarding the source rock for Archean continental crust which is inferred to have had a bulk compostion richer in magnesium (picrite) than present-day basaltic oceanic crust. This difference is supposed to originate from a higher geothermal gradient in the early Archean which may have induced higher degrees of partial melting in the mantle, which resulted in a thicker and more magnesian oceanic crust. rnThe methods used to investigate the role of a more MgO-rich source rock in the formation of TTG-like melts in the context of this new approach are mineral equilibria calculations with the software THERMOCALC and high-pressure experiments conducted from 10–20 kbar and 900–1100 °C, both combined in a forward modelling approach. Initially, P–T pseudosections for natural rock compositions with increasing MgO contents were calculated in the system NCFMASHTO (Na2O–CaO–FeO–MgO–Al2O3–SiO2–H2O–TiO2) to ascertain the metamorphic products from rocks with increasing MgO contents from a MORB up to a komatiite. A small number of previous experiments on komatiites showed the development of pyroxenite instead of eclogite and garnet-amphibolite during metamorphism and established that melts of these pyroxenites are of basaltic composition, thus again building oceanic crust instead of continental crust.rnThe P–T pseudosections calculated represent a continuous development of their metamorphic products from amphibolites and eclogites towards pyroxenites. On the basis of these calculations and the changes within the range of compositions, three picritic Models of Archean Oceanic Crust (MAOC) were established with different MgO contents (11, 13 and 15 wt%) ranging between basalt and komatiite. The thermodynamic modelling for MAOC 11, 13 and 15 at supersolidus conditions is imprecise since no appropriate melt model for metabasic rocks is currently available and the melt model for metapelitic rocks resulted in unsatisfactory calculations. The partially molten region is therfore covered by high-pressure experiments. The results of the experiments show a transition from predominantly tonalitic melts in MAOC 11 to basaltic melts in MAOC 15 and a solidus moving towards higher temperatures with increasing magnesium in the bulk composition. Tonalitic melts were generated in MAOC 11 and 13 at pressures up to 12.5 kbar in the presence of garnet, clinopyroxene, plagioclase plus/minus quartz (plus/minus orthopyroxene in the presence of quartz and at lower pressures) in the absence of amphibole but it could not be explicitly indicated whether the tonalitic melts coexisting with an eclogitic residue and rutile at 20 kbar do belong to the Archean TTG suite. Basaltic melts were generated predominantly in the presence of granulite facies residues such as amphibole plus/minus garnet, plagioclase, orthopyroxene that lack quartz in all MAOC compositions at pressures up to 15 kbar. rnThe tonalitic melts generated in MAOC 11 and 13 indicate that thicker oceanic crust with more magnesium than that of a modern basalt is also a viable source for the generation of TTG-like melts and therefore continental crust in the Archean. The experimental results are related to different geologic settings as a function of pressure. The favoured setting for the generation of early TTG-like melts at 15 kbar is the base of an oceanic crust thicker than existing today or by melting of slabs in shallow subduction zones, both without interaction of tonalic melts with the mantle. Tonalitic melts at 20 kbar may have been generated below the plagioclase stability by slab melting in deeper subduction zones that have developed with time during the progressive cooling of the Earth, but it is unlikely that those melts reached lower pressure levels without further mantle interaction.rn

Imaging and modeling of pore scale processes in porous media using X-ray computed tomography and lattice Boltzmann solver

In der Erdöl– und Gasindustrie sind bildgebende Verfahren und Simulationen auf der Porenskala im Begriff Routineanwendungen zu werden. Ihr weiteres Potential lässt sich im Umweltbereich anwenden, wie z.B. für den Transport und Verbleib von Schadstoffen im Untergrund, die Speicherung von Kohlendioxid und dem natürlichen Abbau von Schadstoffen in Böden. Mit der Röntgen-Computertomografie (XCT) steht ein zerstörungsfreies 3D bildgebendes Verfahren zur Verfügung, das auch häufig für die Untersuchung der internen Struktur geologischer Proben herangezogen wird. Das erste Ziel dieser Dissertation war die Implementierung einer Bildverarbeitungstechnik, die die Strahlenaufhärtung der Röntgen-Computertomografie beseitigt und den Segmentierungsprozess dessen Daten vereinfacht. Das zweite Ziel dieser Arbeit untersuchte die kombinierten Effekte von Porenraumcharakteristika, Porentortuosität, sowie die Strömungssimulation und Transportmodellierung in Porenräumen mit der Gitter-Boltzmann-Methode. In einer zylindrischen geologischen Probe war die Position jeder Phase auf Grundlage der Beobachtung durch das Vorhandensein der Strahlenaufhärtung in den rekonstruierten Bildern, das eine radiale Funktion vom Probenrand zum Zentrum darstellt, extrahierbar und die unterschiedlichen Phasen ließen sich automatisch segmentieren. Weiterhin wurden Strahlungsaufhärtungeffekte von beliebig geformten Objekten durch einen Oberflächenanpassungsalgorithmus korrigiert. Die Methode der „least square support vector machine” (LSSVM) ist durch einen modularen Aufbau charakterisiert und ist sehr gut für die Erkennung und Klassifizierung von Mustern geeignet. Aus diesem Grund wurde die Methode der LSSVM als pixelbasierte Klassifikationsmethode implementiert. Dieser Algorithmus ist in der Lage komplexe geologische Proben korrekt zu klassifizieren, benötigt für den Fall aber längere Rechenzeiten, so dass mehrdimensionale Trainingsdatensätze verwendet werden müssen. Die Dynamik von den unmischbaren Phasen Luft und Wasser wird durch eine Kombination von Porenmorphologie und Gitter Boltzmann Methode für Drainage und Imbibition Prozessen in 3D Datensätzen von Böden, die durch synchrotron-basierte XCT gewonnen wurden, untersucht. Obwohl die Porenmorphologie eine einfache Methode ist Kugeln in den verfügbaren Porenraum einzupassen, kann sie dennoch die komplexe kapillare Hysterese als eine Funktion der Wassersättigung erklären. Eine Hysterese ist für den Kapillardruck und die hydraulische Leitfähigkeit beobachtet worden, welche durch die hauptsächlich verbundenen Porennetzwerke und der verfügbaren Porenraumgrößenverteilung verursacht sind. Die hydraulische Konduktivität ist eine Funktion des Wassersättigungslevels und wird mit einer makroskopischen Berechnung empirischer Modelle verglichen. Die Daten stimmen vor allem für hohe Wassersättigungen gut überein. Um die Gegenwart von Krankheitserregern im Grundwasser und Abwässern vorhersagen zu können, wurde in einem Bodenaggregat der Einfluss von Korngröße, Porengeometrie und Fluidflussgeschwindigkeit z.B. mit dem Mikroorganismus Escherichia coli studiert. Die asymmetrischen und langschweifigen Durchbruchskurven, besonders bei höheren Wassersättigungen, wurden durch dispersiven Transport aufgrund des verbundenen Porennetzwerks und durch die Heterogenität des Strömungsfeldes verursacht. Es wurde beobachtet, dass die biokolloidale Verweilzeit eine Funktion des Druckgradienten als auch der Kolloidgröße ist. Unsere Modellierungsergebnisse stimmen sehr gut mit den bereits veröffentlichten Daten überein.