Einfluss der Modulation von P-Glykoprotein (P-gp) auf die Verfügbarkeit und Wirksamkeit der pharmakologischen Behandlung psychiatrischer Erkrankungen im Tiermodell

P-Glykoprotein (P-gp) ist ein ATP-verbrauchender Transporter, der in Organschranken exprimiert wird, um Fremdstoffe auszuschleusen, darunter auch Psychopharmaka. Im Rahmen dieser Arbeit wurde im Tiermodell der Maus untersucht, welche pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Konsequenzen sich bei Verabreichung von Risperidon als P-gp Modellsubstrat ergeben, wenn die Expression von P-gp induziert wird. Als potenzielle Induktoren wurden Dexamethason, Rifampicin, Quercetin, 5-Pregnen-3ß-ol-20-on-16α-Carbonitril (PCN) und Acitretin geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle Substanzen die Verteilung von Risperidon und seinem aktiven Metaboliten 9-Hydroxyrisperidon beeinflussten. Während sich für Quercetin und Acitretin leichte P-gp inhibitorische Eigenschaften ergaben, die an Hand von erhöhten Konzentrationen von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon gezeigt werden konnten, führten die bekannten P-gp Induktoren Rifampicin, Dexamethason und PCN zu verringerten Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Durch Western Blot Untersuchungen wurde bestätigt, dass die Induktoren die P-gp Expression im Hirngewebe tendenziell steigerten. Dies sprach dafür, dass bei Verabreichung einer Komedikation, die P-gp induziert, mit einer veränderten Verteilung von P-gp Substraten zu rechnen ist. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass durch eine Hemmung bzw. Induktion von P-gp nicht nur die Pharmakokinetik, sondern auch die Pharmakodynamik von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon verändert wird. Dies wurde durch verhaltenspharmakologische Untersuchungen gezeigt. Durch Risperidon induzierte motorische Effekte auf dem RotaRod waren nach Induktion von P-gp abgeschwächt. Dies zeigte sich auch für Haloperidol, welches kein Substrat ist. Da P-gp abhängige Effekte in diesem Fall keine bedeutende Rolle spielen, ist davon auszugehen, dass neben der Induktion von P-gp an der Blut-Hirn Schranke auch andere Mechanismen wie z.B. eine Induktion von Enzymen der CYP-Familie an den beobachteten Effekten beteiligt sind. Bei Untersuchungen von kognitiven Leistungen in der Barnes Maze konnte gezeigt werden, dass Haloperidol im Gegensatz zu Risperidon das Lernverhalten negativ beeinflussen kann. Eine P-gp Induktion schien jedoch keinen deutlichen Einfluss auf das Lernverhalten unter Antipsychotika-Gabe zu haben und sprach vielmehr für substanzabhängige Effekte der einzelnen Antipsychotika bzw. P-gp Modulatoren. Zusatzuntersuchungen zur Hirngängigkeit von Acitretin, einem synthetischen Retinoid, welches derzeit als potenzielles Antidementivum geprüft wird, konnten belegen, dass es die Blut-Hirn Schranke überwindet. Bereits 1h nach Injektion war Acitretin in hoher Konzentration im Gehirn nachweisbar. Durch die Analyse zur Verteilung von Acitretin in Hirngewebe und Serum von P-gp Wildtyp und P-gp doppel knockout Mäusen konnte belegt werden, dass Acitretin nicht P-gp abhängig transportiert wird. Die Daten insgesamt betrachtet, lassen den Schluss zu, dass durch Verabreichung von Medikamenten, die P-gp Modulatoren sind, bei Antipsychotika mit pharmakokinetischen Interaktionen zu rechnen ist, welche die Wirksamkeit der Medikamente einschränken können.

In vivo and in vitro investigation of the tissue-specific activity of the human CYP3A4 and CYP3A5 promoters

The human cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), the predominant but variably expressed cytochrome P450 in adult liver and small intestine is involved in the metabolism of over 50% of currently used drugs. Its paralog CYP3A5 plays a crucial role in the disposition of several drugs with low therapeutic index, including tacrolimus. Limited information is available for the CYP3A5 transcriptional regulation and its induction by xenobiotics remains controversial. In the first part of this study, we analysed the CYP3A5 transcriptional regulation and its induction by xenobiotics in vivo using transgenic mice. To this end, two transgenic strains were established by pronuclear injection of a plasmid, expressing firefly luciferase driven by a 6.2 kb of the human CYP3A5 promoter. A detailed analysis of both strains shows a tissue distribution largely reflecting that of CYP3A5 transcripts in humans. Thus, the highest luciferase activity was detected in the small intestine, followed by oesophagus, testis, lung, adrenal gland, ovary, prostate and kidney. However, no activity was observed in the liver. CYP3A5-luc transgenic mice were similarly induced in both sexes with either PCN or TCPOBOP in small intestine in a dose-dependent manner. Thus, the 6.2 kb upstream promoter of CYP3A5 mediates the broad tissue activity in transgenic mice. CYP3A5 promoter is inducible in the small intestine in vivo, which may contribute to the variable expression of CYP3A in this organ. rnThe hepato-intestinal level of the detoxifying oxidases CYP3A4 and CYP3A5 is adjusted to the xenobiotic exposure mainly via the xenosensor and transcriptional factor PXR. CYP3A5 is additionally expressed in several other organs lacking PXR, including kidney. In the second part of this study, we investigated the mechanism of the differential expression of CYP3A5 and CYP3A4 and its evolutionary origin using renal and intestinal cells, and comparative genomics. For this examination, we established a two-cell line models reflecting the expression relationships of CYP3A4 and CYP3A5 in the kidney and small intestine in vivo. Our data demonstrate that the CYP3A5 expression in renal cells was enabled by the loss of a suppressing Yin Yang 1 (YY1)-binding site from the CYP3A5 promoter. This allowed for a renal CYP3A5 expression in a PXR-independent manner. The YY1 element is retained in the CYP3A4 gene, leading to its suppression, perhaps via interference with the NF1 activity in renal cells. In intestinal cells, the inhibition of CYP3A4 expression by YY1 is abrogated by a combined activating effect of PXR and NF1 acting on their respective response elements located adjacent to the YY1-binding site on CYP3A4 proximal promoter. CYP3A4 expression is further facilitated by a point mutation attenuating the suppressing effect of YY1 binding site. The differential expression of CYP3A4 and CYP3A5 in these organs results from the loss of the YY1 binding element from the CYP3A5 promoter, acting in concert with the differential organ expression of PXR, and with the higher accumulation of PXR response elements in CYP3A4. rn

Die Rolle der humanen Enzyme Paraoxonase-2 und -3 bei Krebserkrankungen und Pseudomonas-Infektionen

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Charakterisierung molekularer Funktionen humaner Paraoxonase (PON) Enzyme, insbesondere die der Proteine PON2 und PON3 im Hinblick auf medizinisch-relevante Fragestellungen. Zum einen wurde die Rolle von PON3 in der Tumorgenese und zum anderen eine mögliche Schutzfunktion von PON2 und PON3 gegenüber P. aeruginosa Infektionen untersucht. Bereits seit dem Jahr 2000 ist die anti-oxidative Eigenschaft von PON3 bekannt, jedoch war der zugrundeliegende Mechanismus bisher ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PON3 die Superoxid-Entstehung in den Mitochondrien abschwächt, wobei sie ihre anti-oxidative Eigenschaft vermutlich durch eine direkte Coenzym Q10-Interaktion in der inneren mitochondrialen Membran vermittelt. Dies führt zu weniger oxidativen Stress, zur Abschwächung mitochondrial-induzierter apoptotischer Signalwege und zur erhöhten Resistenz gegenüber Chemotherapeutika. Gleichzeitig wurde demonstriert, dass sich Tumorzellen diese anti-oxidative Eigenschaft zu Nutze machen. PON3 war in zahlreichen Tumorgeweben überexprimiert. Es konnte eine mögliche Funktion von PON3 als Tumormarker und Angriffspunkt in der Krebstherapie aufgezeigt werden. Die hier erlangten Daten liefern wertvolle Hinweise auf die Rolle von PON3 in Krebserkrankungen, welche eine Basis für zukünftige Analysen darstellen, die der Entwicklung neuer Krebstherapien dienen könnten. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit der gegenseitigen Beeinflussung der Enzyme PON2 / PON3 und der für P.aeruginosa essentiellen Virulenzfaktoren Pyocyanin (PCN) und dem Lacton 3OC12. Erstmalig wurde gezeigt, dass PON3 zellschädigende PCN-Effekte abschwächen kann, nämlich die PCN-induzierte Superoxid-Produktion, NF-kB-Aktivierung und IL-8-Sekretion. PON2 schützt in gleicher Weise gegen PCN und hydrolysiert zugleich noch das Lacton 3OC12. Folglich sind PON2 und PON3 wichtige Bestandteile der angeborenen Immunität, werden jedoch durch eine 3OC12-induzierte Ca2+-Mobilisation inaktiviert. Weitere Analysen ergaben, dass die PON2-Inaktivierung wahrscheinlich über einen Ca2+ / Calcineurin / Calmodulin-abhängigen Signalweg erfolgt, welcher eine offenbar regulative Serin311-Dephosphorylierung in PON2 vermittelt. Ähnliches könnte für PON3 gelten und wird derzeit erforscht, da eine Stabilisierung der enzymatischen Aktivitäten von PON2 und PON3 der bakteriellen Virulenz entscheidend entgegen wirken könnte.

Unmittelbare, dauerhafte sowie evolutionäre Anpassung an Fremdstoffexpositionen

Eine der Hauptursachen für unerwünschte oder reduzierte Wirkungen von Medikamenten ist die Induktion von Enzymen und Transportern des Medikamentenstoffwechsels. Diese Induktion stellt ursprünglich eine physiologische Reaktion auf die Aufnahme von potentiell schädlichen Fremdstoffen aus der Umwelt dar und sichert so die Gesundheit und Fortpflanzungsfähigkeit von Lebewesen. Beim Menschen sowie anderen Säugetieren werden Fremdstoffe hauptsächlich von den nukleären Rezeptoren PXR und CAR in der Leber und im Dünndarm detektiert. Zu den Medikamenten, welche über PXR und CAR wirken, gehören unter anderem Antikonvulsiva, Statine, antiretrovirale Medikamente, Glucocorticoide sowie Antimykotika. Die durch Fremdstoffe aktivierten Transkriptionsfaktoren PXR und CAR steigern die Menge der Enzyme und Transporter des Fremdstoffmetabolismus. Hierzu zählen vor allem die Cytochrom P450-Enzyme (Cyp-Enzyme) mit breitem Substratspektrum oder der Transporter MDR1, welcher eine Vielzahl von Substraten über Membranen transportiert. Durch die Biotransformation werden die induzierenden, lipophilen Substanzen so modifiziert, dass sie leichter über den Urin oder die Galle ausgeschieden werden können. \r\nDie Dauer der Induktion sollte auf die Zeit der Fremdstoffexposition beschränkt sein, um Störungen des endogenen Stoffwechsels zu vermindern. In dieser Arbeit werden jedoch Hinweise auf dauerhafte und sogar generationsübergreifende Effekte von Medikamenten in Mäusen geliefert. Nachkommen von Müttern, welche bereits vor ihrer Verpaarung einmalig mit TCPOBOP, einem Liganden des murinen CAR, injiziert wurden, hatten eine ungefähr 100-fach gesteigerte Genexpression von Cyp2b10. Auch gab es Expressionsänderungen von Genen, deren Produkte eine Rolle im Lipidstoffwechsel sowie bei Immunkrankheiten spielen. Eine Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung der injizierten Elterngeneration ergab außerdem dauerhafte Expressionsveränderungen anderer Gene des Medikamentenstoffwechsels sowie von Genen mit Verbindung zum Energiemetabolismus. \r\nBerücksichtigt man die enge evolutionäre Verwandtschaft der nukleären Rezeptoren CAR und PXR, sind Langzeitveränderungen auch für PXR möglich und wurden im Verlauf dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Eine Hochdurchsatz-Sequenzierung ergab für Mäuse, welche mit dem PXR-Aktivator PCN induziert wurden, dass selbst noch drei Monate nach der Exposition Gene verändert exprimiert waren, welche im Zusammenhang mit Lebernekrosen stehen. Bei Nachkommen von PCN-injizierten Müttern wurden Gene unterschiedlich exprimiert, welche eine Rolle bei der Energiehomöostase sowie im Glukosestoffwechsel spielen. Im Erwachsenenalter sind bei diesen Nachkommen darüber hinaus noch Gene unterschiedlich exprimiert, deren Produkte eine Funktion in der Immunantwort haben. \r\nDa Erwachsene aufgrund ihrer Lebensdauer sowie der absoluten Krankheitshäufigkeit wesentlich öfter Kontakt mit Fremdstoffen haben, war medizinisch von besonderem Interesse, ob anhaltende Genexpressionsänderungen auch bei Erwachsenen zu beobachten sind. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch einmalig exponierte Adulttiere Gene dauerhaft verändert exprimieren und die Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel an die nächste Generation übertrugen. \r\n\r\nBisher sind klinische Studien zur Risikobewertung von Medikamenten (Pharmakovigilanz) nicht generationsübergreifend angelegt. Diese Arbeit gibt Anstöße dafür, dass dies in Zukunft für viel mehr Medikamente notwendig werden könnte. Neben Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel ergeben sich Nebenwirkungen von PXR- und CAR-Liganden vor allem aus ihrer Beteiligung an endogenen Stoffwechselwegen. Nach Aktivierung von CAR, welcher viele metabolische Stoffwechselwege steuert, treten beispielsweise Störungen des Energiestoffwechsels auf. Ein tieferes Verständnis der Rezeptoraktivität von CAR samt einer gezielten Modulierung seiner Aktivität würde wichtige Beiträge zum Verständnis der Regulation des Fremdstoffmetabolismus sowie der Entstehung von Nebenwirkungen durch eine Behandlung mit CAR-Liganden leisten. Dauerhafte Veränderungen endogener Stoffwechselwege könnten dann möglicherweise über eine pharmakologische Modulierung der CAR-Aktivität reduziert werden. \r\nZu diesem Zweck wurden im Verlauf dieser Arbeit die CAR-Rezeptoren der Amphibien (Xenopus tropicalis, Xenopus laevis) und Reptilien (Anolis carolinensis) erstmals kloniert, als Proteine exprimiert und charakterisiert. Vergleiche zwischen Tierarten ermöglichen ein besseres Verständnis von humanen Proteinen. Funktionelle Analysen ergaben Ähnlichkeiten des Xenopus laevis-CAR mit dem PXR der Säugetiere: eine niedrige basale Aktivität sowie eine starke Induzierbarkeit durch Liganden. In weiteren funktionellen Analysen wurden die Determinanten der basalen Aktivität des Xenopus laevis-CAR untersucht. Die basale Aktivität war nicht abhängig von der subzellulären Lokalisation, sondern ergab sich aus der Proteinstruktur, welche nur beim CAR der Landvertebraten in einer aktiven Konformation fixiert ist. Ähnlich dem PXR der Säugetiere besitzt CAR der Amphibien eine Aktivierungsdomäne, welche erst durch Ligandenbindung in eine aktive Konformation gebracht wird. Mutationen einzelner Aminosäuren zum jeweils humanen Homolog erhöhten die basale Aktivität des Xenopus laevis-CAR auf die des humanen Rezeptors. Diese Mutanten mit erhöhter basalen Aktivität zeigten eine verstärkte Interaktion mit dem Kofaktor PGC-1a, einem Regulator des Energiestoffwechsels bei Säugetieren. Die hepatischen Zielgene des CAR der Amphibien überlappen zum Teil mit den humanen Zielgenen und spielen ebenfalls eine Rolle im Energiestoffwechsel.