Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schlüsselmolekül zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine große Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in frühen Phasen als Tumorsuppressor, währenddessen es in späten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher für ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Spleißform des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. Für diese Spleißform konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Überexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine veränderte Lokalisation der Smurf2 Spleißformen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Spleißen des Exons2 führte dabei zu Änderungen der Topologie der N-terminalen C2-Domäne, wodurch sich eine veränderte Lokalisation in der Zelle beschreiben ließ. Mit der veränderten intrazellulären Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine Änderung. So konnte überraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine Überexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verstärkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegenüber TGF-beta. Dies führte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse bestätigt werden konnte, daß das dE2Smurf2 nach Überexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abhängig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, daß durch die höhere Sensitivität gegenüber TGF-beta naive T-Zellen unter Einfluß von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, daß die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INFγ produzierten.So zeigten in vivo Versuche, daß die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entzündung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine stärkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INFγ und Granzym B erklärt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten Mäuse, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant stärkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer Überproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erklärt werden. Klonierungsexperimente führten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell über die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein für die Modulation von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.