Blood-CNS barriers in neurodegenerative diseases

The blood-brain barrier (BBB) and the blood-spinal cord barrier (BSCB) separate the brain and the spinal cord from the circulating blood and are important for the maintenance of the CNS homeostasis. They build a physical barrier thereby protecting the CNS from pathogens and toxic agents, and their disruption plays a crucial role in the pathogenesis of several CNS disorders. In this thesis, the blood-CNS-barriers were studied via in vitro models in two case studies for neurodegenerative disorders, in particular Alzheimer’s disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The first model evaluates treatment possibilities of AD using nanotechnology-based strategies. Since the toxic amyloid-β42 (Aβ42) peptide plays a crucial role in the pathogenesis of AD, reduced generation or enhanced clearance of Aβ42 peptides are expected to modify the disease course in AD. Therefore, several Aβ42-lowering drugs like flurbiprofen had been tested in clinical trials, but most of them failed due to their low brain penetration. Here, flurbiprofen was embedded in polylactide (PLA) nanoparticles and its transport was examined in an in vitro BBB model. The embedding of flurbiprofen into the nanoparticles disguised its cytotoxic potential and enabled the administration of higher drug concentrations which resulted in a sufficient transport of the drug across an endothelial cell monolayer. These results demonstrate that non-permeable drugs can be transported efficiently via nanoparticles and that these nanotechnology-based strategies are a promising tool to generate novel therapeutic options for AD and other CNS diseases. rnThe focus of the second project was to investigate the impaired integrity of the BSCB in a mouse model for ALS. About 20% of all familial ALS cases are associated with missense mutations or small deletions in the gene that encodes Cu/Zn-superoxide dismutase 1 (SOD1). To date, the molecular mechanisms resulting in ALS are still unknown, but there is evidence that the disruption of the BSCB is one of the primary pathological events. In both familial and sporadic ALS patients, loss of endothelial integrity and endothelial cell damage was observed, and studies with SOD1 transgenic mice demonstrated that the BSCB disruption was found prior to motor neuron degeneration and neurovascular inflammation. Thus, an in vitro model for ALS endothelial cells was generated which exhibited comparable integrity characteristics and tight junction (TJ) protein expression profiles as isolated primary endothelial cells of the BSCB of SOD1 transgenic mice. In this, an alteration of the βcat/AKT/FoxO1 pathway, which regulates the expression of the TJ protein claudin-5, could be observed. These data furthermore indicate that ALS is a neurovascular disease, and understanding of the primary events in ALS pathogenesis will hopefully provide ideas for the development of new therapeutic strategies. rn

LRP1 modulates APP trafficking and APP metabolism within compartments of the secretory pathway. Increased AICD generation is ineffective in nuclear translocation and transcriptional activation

LRP1 modulates APP trafficking and metabolism within compartments of the secretory pathway The amyloid precursor protein (APP) is the parent protein to the amyloid beta peptide (Abeta) and is a central player in Alzheimer’s disease (AD) pathology. Abeta liberation depends on APP cleavage by beta- and gamma-secretases. To date, only a unilateral view of APP processing exists, excluding other proteins, which might be transported together and/or processed dependent on each other by the secretases described above. The low density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP1) was shown to function as such a mediator of APP processing at multiple steps. Newly synthesized LRP1 can interact with APP, implying an interaction between these two proteins early in the secretory pathway. Therefore, we wanted to investigate whether LRP1 can mediate APP trafficking along the secretory pathway, and, if so, whether it affects APP processing. Indeed, we demonstrate that APP trafficking is strongly influenced by LRP1 transport through the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi compartments. LRP1-constructs with ER- and Golgi-retention motifs (LRP-CT KKAA, LRP-CT KKFF) had the capacity to retard APP trafficking at the respective steps in the secretory pathway. Here, we provide evidence that APP metabolism occurs in close conjunction with LRP1 trafficking, highlighting a new role of lipoprotein receptors in neurodegenerative diseases. Increased AICD generation is ineffective in nuclear translocation and transcriptional activity A sequence of amyloid precursor protein (APP) cleavages gives rise to the APP intracellular domain (AICD) together with amyloid beta peptide (Abeta) and/or p3 fragment. One of the environmental factors identified favouring the accumulation of AICD appears to be a rise in intracellular pH. This accumulation is a result of an abrogated cleavage event and does not extend to other secretase substrates. AICD can activate the transcription of artificially expressed constructs and many downstream gene targets have been discussed. Here we further identified the metabolism and subcellular localization of the constructs used in this well documented gene reporter assay. We also co-examined the mechanistic lead up to the AICD accumulation and explored possible significances for its increased expression. We found that most of the AICD generated under pH neutralized conditions is likely that cleaved from C83. Furthermore, the AICD surplus is not transcriptionally active but rather remains membrane tethered and free in the cytosol where it interacts with Fe65. However, Fe65 is still essential in AICD mediated transcriptional transactivation although its exact role in this set of events is unclear.

Synthese, Tritierung, 99m Tc-Markierung und Evaluierung von Benzamid-Derivaten zur Visualisierung der D 2, D 3-Rezeptoren

Die Diagnose und Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, wie beispielsweise Morbus Parkinson besitzt in der heutigen Gesellschaft eine immer größere Bedeutung. Über moderne, bild¬gebende nuklear¬medizinische Verfahren wie SPECT und PET ist es mit geeigneten Radioliganden möglich, Morbus Parkinson vor dem Auftreten von Symptomen zu diagnostizieren. Ein wichtiger Ansatzpunkt zur Diagnose von Morbus Parkinson ist die Visualisierung der postsynaptischen Dopamin-Rezeptoren über radioaktiv (11C, 18F, 123I) markierte Benz¬amid-Derivate. Auf Grundlage der (S)-Pyrolidin-2,3-dimethoxy-Benzamid-Struktur des 18F-Liganden Fallypride wurden verschiedene 99mTc-markierte Benzamid-Derivate als potentielle Radio¬liganden zur Parkinson-Diagnostik entwickelt. Um das Potential von Metall-konjugierten Benzamiden abschätzen zu können, wurden zunächst einfache Vergleichssubstanzen entwickelt. Diese sollten die Einführung eines Chelators simulieren und wurden hierfür hinsichtlich ihrer in vitro-Bindungsaffinitäten zu den Dopamin-, Serotonin- und adrenergen Rezeptoren evaluiert. Die zunächst entwickelten Derivate mit unterschiedlichen Kettenlängen zur Kopplung des Chelators zeigten für die Propylkette Affinitäten im nanomolaren Bereich. Im Anschluss sollten basierend auf diesen Ergebnissen vier verschiedene Chelatoren (Carbony-Cyclopentadienyl, Amido-Cyclopentadienyl, 2-Pyridyl-Imin und N2S2) über eine Propylkette an die 5-Position der Benzamidgrundstruktur gekoppelt werden. Die geplante Synthese des Carbonyl-Cyclopentadienyl-Derivates gelang jedoch nicht. Für die weiteren Chelatoren (Amido-Cyclopentadieny, 2-Pyridyl-Imin und N2S2) konnten die jeweiligen Markierungs¬vorläufer und Rhenium-Komplexe dargestellt werden, die ebenfalls hinsichtlich ihrer Bindungs¬affinitäten evaluiert wurden. Die erzielten Affinitäten zeigten, dass eine Über¬tragung der Affinitäten der einfachen Vergleichssubstanzen auf die komplexeren Metall-Benzamide nicht möglich war. Insbesondere der N2S2-Rhenium-Komplex besitzt nur noch geringe Affinität (490 - 900 nM) zu den D2- und D3-Rezeptoren. Die mittel-affinen 2-Pyridyl-Imin- und Amdio¬cyclopentadien-Komplexe wurden mit 99mTc markiert und die Markierungsausbeute hinsichtlich Reaktionstemperatur, Markierungs-vorläuferkonzentration und Heizmethoden optimiert. Dabei konnte der Imin-Komplex quantitativ mittels fac-[99mTc(CO)3(H2O)3]+ in 30 Minuten bei 45°C markiert werden. Der Amido-Cyclopentadien-Komplex konnte über die Umsetzung des Ferrocen-Markierungsvorläufer mit Mn(CO)5Br und [99mTcO4]- in Ausbeuten von bis zu 60 % markiert werden. Im Anschluss an die Markierungen wurden die 99mTc-Komplexe über HPLC isoliert und in in vitro-Auto¬radiographien von Rattenhirnschnitten weiter evaluiert. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten die für die Rhenium-Komplexe erzielten Affinitäten und zeigten keine spezifische Anreicherung in bestimmten Hirnarealen. Aus diesen Ergebnissen kann ge¬schlossen werden, dass die dargestellten 99mTc-Benzamide aufgrund mangelnder Affinitäten und einer hohen unspezifischen Bindung keine geeigneten Liganden zur Darstellung der D2- und D3- Rezeptoren sind. Um die dargestellten 99mTc-Benzamide mit [18F]Fallypride vergleichen zu können, wurde zusätzlich [3H]Fallypride dargestellt. Hierfür wurde zunächst der Nor-Markierungsvor¬läufer synthetisiert und die Markierungsausbeute optimiert. Die finale Umsetzung mit [3H]Methylnosylat ergab nach HPLC-Aufreinigung 15 mCi [3H]Fallypride mit einer radio¬chemischen Reinheit von >99,5 %. Erste Autoradiographien zeigten eine hohe Anreicherung des Liganden im Striatum, verbunden mit einer sehr niedrigen unspezifischen Bindung.

Relevanz der Methioninoxidation aus evolutionärer Sicht und im akuten oxidativen Stressmodell der Alzheimerschen Krankheit

Im Laufe der Evolution müssen Sauerstoff-metabolisierende Organismen eine Reihe von Anpassungen entwickelt haben, um in der zytotoxischen oxidativen Umgebung der sauerstoff-haltigen Erdatmosphäre überleben zu können. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten vergleichenden Analysen mitochondrial kodierter und kern-kodierter Proteome mehrerer hundert Spezies haben ergeben, dass die Evolution eines alternativen genetischen Codes in Mitochondrien eine moderne Adaptation in diesem Sinne war. Viele aerobe Tiere und Pilze dekodieren in Abweichung vom genetischen Standard-Code das Codon AUA als Methionin. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese Spezies dadurch eine massive Akkumulation der sehr leicht oxidierbaren Aminosäure Methionin in ihren Atmungskettenkomplexen erreichen, die generell ein bevorzugtes Ziel reaktiver Sauerstoffspezies sind. Der gewonnene Befund lässt sich widerspruchsfrei nur unter Annahme einer antioxidativen Wirkung dieser Aminosäure erklären, wie sie erstmals 1996 von R. Levine anhand von Oxidationsmessungen in Modellproteinen postuliert worden war. In der vorliegenden Arbeit wird diese Hypothese nun direkt mittels neuartiger Modellsubstanzen in lebenden Zellen bestätigt. Die durchgeführten bioinformatischen Analysen und zellbiologischen Experimente belegen, dass kollektive Proteinveränderungen die Triebkraft für die Evolution abweichender genetischer Codes sein können.rnDie Bedeutung von oxidativem Stress wurde darüber hinaus auch im Referenzrahmen einer akuten oxidativen Schädigung im Einzelorganismus untersucht. Da oxidativer Stress in der Pathogenese altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimerschen Krankheit prominent involviert zu sein scheint, wurden die Auswirkungungen von Umwelt-induziertem oxidativem Stress auf den histopathologischen Verlauf in einem transgenen Modell der Alzheimerschen Krankheit in vivo untersucht. Dabei wurden transgene Mäuse des Modells APP23 im Rahmen von Fütterungsversuchen einer lebenslangen Defizienz der Antioxidantien Selen oder Vitamin E ausgesetzt. Während die Selenoproteinexpression durch die selendefiziente Diät gewebespezifisch reduziert wurde, ergaben sich keine Anzeichen eines beschleunigten Auftretens pathologischer Marker wie amyloider Plaques oder Neurodegeneration. Es war vielmehr ein unerwarteter Trend hinsichtlich einer geringeren Plaquebelastung in Vitamin E-defizienten Alzheimermäusen zu erkennen. Auch wenn diese Daten aufgrund einer geringen Versuchstiergruppengröße nur mit Vorsicht interpretiert werden dürfen, so scheint doch ein Mangel an essentiellen antioxidativen Nährstoffen die Progression in einem anerkannten Alzheimermodell nicht negativ zu beeinflussen.rn

Der Wirkungsmechanismus von Neurosteroiden auf das Cytoskelett neuronaler Zellen

Neurosteroide können langsame genomische und schnelle nicht-genomische Effekte zeigen. Die Synthese und der Metabolismus von Neurosteroiden werden entwicklungsbedingt reguliert. In den letzten Jahren sind immer mehr schnelle Steroideffekte bekannt geworden, die sowohl über klassische als auch über nicht-klassische Rezeptoren laufen. Zum heutigen Stand der Forschung sind die morphologischen Effekte von Neurosteroiden auf das neuronale Cytoskelett und die involvierten Signalkaskaden noch weitgehend unerforscht. In diesem Zusammenhang stellen sich auch die Fragen nach den verantwortlichen Rezeptoren und dem Transportmechanismus sowie der subzellulären Lokalisation der Steroide. Die im Rahmen meiner Promotion erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Steroide DHEA und Testosteron eine Reorganisation des Aktincytoskeletts in neuronalen Zellen induzieren und dass diese Effekte diesen Steroiden und nicht ihren Folgemetaboliten zuzuordnen sind. DHEA bewirkt die Kontraktion der Zellen, eine erhöhte Ausbildung von Stressfasern und fokalen Adhäsionskomplexen sowie die Bildung von Filopodien. Der diesen Effekten zu Grunde liegende Signalweg konnte eindeutig identifiziert werden. DHEA induziert in neuronalen Zellen die Aktivierung des Rho-Signalwegs. Diese Aktivierung führt zu einem erhöhten Phosphorylierungsstatus der regulatorischen leichten Kette von Myosin II (MRLC) an Serin 19 und der damit verbundenen erhöhten Myosin-Aktin-Interaktion. Die Ausbildung von Filopodien wird vermutlich über eine Aktivierung der GTPase Cdc42 vermittelt. Testosteron induziert das Auswachsen langer Neuriten sowie eine Verminderung von Stressfasern in neuronalen Zellen. Diese Effekte sind abhängig von der Aktivität der PI3-Kinase. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Testosteron über die PI3-Kinase und FAK den Rac-Signalweg induziert, da es zu einer Inhibierung des Rho-Signalwegs kommt. Zahlreiche Erkenntnisse weisen darauf hin, dass DHEA und Testosteron die Aktivierung der beteiligten Signalwege über einen G-Protein gekoppelten Rezeptor induzieren. DHEA und Testosteron beeinflussen auch die Expression und die Lokalisation der regulatorischen leichten Ketten von Myosin II. Im Gegensatz zu DHEA (Lokalisation der MRLC in der kortikalen Region der Zelle), induziert Testosteron eine Umlokalisation der MRLC in den Zellkern. Daher ist es denkbar, dass die MRLCs, wie auch Aktin, als Transkriptionsfaktoren wirken können. Die Synthese eines funktionalen, fluoreszierenden DHEA-Derivats (DHEA-Bodipy) ermöglichte erstmals, den Transport und die subzelluläre Lokalisation von DHEA in neuronalen Zellen zu beobachten. DHEA-Bodipy wird in neuronalen Zellen in den Mitochondrien lokalisiert. Diese Lokalisation ergibt völlig neue Ansätze im Verständnis zellulärer Wirkungsorte von Steroiden und beteiligter Rezeptoren. Das in meiner Arbeit vorgestellte Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Steroiden bietet vielfältige Möglichkeiten im Einsatz zellbiologischer Methoden. Nach diesem Verfahren hergestellte, fluoreszierende Steroide eignen sich aufgrund ihrer Stabilität sehr gut für die Untersuchung des Transports und der subzellulären Lokalisation von Steroiden an fixierten und lebenden Zellen sowie für Colokalisationsexperimente. Diese Methode grenzt somit auch die Anzahl möglicher molekularer Interaktionspartner ein. Für Testosteron konnte ebenfalls ein fluoreszierendes Testosteron-Derivat (Testosteron-Bodipy) synthetisiert werden. Die Aufklärung der Effekte von Steroiden auf das neuronale Cytoskelett und der beteiligten Signalkaskaden sowie die Identifizierung der zellulären Wirkungsorte ermöglichen therapeutische Ansätze zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, deren Ursachen in Abnormitäten des Cytoskeletts oder fehlregulierter Neurosteroidogenese zu begründen sind.

Synthese, biochemische und physikochemische Charakterisierung von Liganden der Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors

Die exzitatorische Neurotransmission erfolgt über ionotrope Glutamat-Rezeptoren von denen dem NMDA-(N-Methyl-D-aspartat)-Rezeptor durch seine hohe Leitfähigkeit für Ca2+-Ionen eine besondere Rolle zugesprochen wird. Bei seiner Überaktivierung kommt es zu exzitotoxischen Prozessen, die direkt mit neurodegenerativen Erkrankungen einhergehen und nach einem Schlaganfall, bei akuten Epilepsien, Morbus Parkinson, Alzheimer Demenz aber auch im Bereich der neuropathischen Schmerzentstehung eine wichtige Rolle spielen.rnDurch das Eingreifen in die glutamatvermittelten pathologischen Prozesse verspricht man sich daher die Möglichkeit einer Neuroprotektion bei der Therapie verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, die primär auf völlig unterschiedliche Ursachen zurückzuführen sind.rnAusgehend von in früheren Arbeiten synthetisierten Hydantoin-substituierten Dichlor-indol-2-carbonsäure-Derivaten, die hochaffine Eigenschaften zur Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors aufweisen, sollten neue Derivate entwickelt und untersucht werden, die hinsichtlich ihrer Affinität zur Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors, ihrer Pharmakokinetik sowie physikochemischen Parameter in präparativ-organischen, radiopharmazeutischen und zell- bzw. tierexperimentellen Studien in vitro sowie in vivo charakterisiert werden sollten. Von besonderem Interesse war dabei die Evaluierung der synthetisierten Verbindungen in einem Verdrängungsassay mit dem Radioliganden [3H]MDL105,519 mit dem der Einfluss der strukturellen Modifikationen auf die Affinität zur Glycin-Bindungsstelle des Rezeptors untersucht wurde, sowie die Selektivität und die Potenz der Liganden abgeschätzt wurde.rnIm Rahmen der Struktur-Wirkungs-Untersuchungen mit Hilfe der Bindungsexperimente konnten bestimmte Strukturmerkmale als essentiell herausgestellt bzw. bekräftigt werden. Die Testverbindungen zeigten dabei IC50-Werte im Bereich von 0,0028 bis 51,8 μM. Die entsprechenden Ester dagegen IC50-Werte von 23,04 bis >3000 μM. Als vielversprechende Strukturen mit Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich stellten sich Derivate mit einer 4,6-Dichlor-oder Difluor-Substitution am Indolgrundgerüst (2,8 bis 4,6 nM) heraus. Auch die Substitution des Phenylhydantoin-Teils durch das bioisostere Thienylhydantoin führte zu einer gleichbleibenden ausgeprägten Affinität (3,1 nM). rnZur Abschätzung der Bioverfügbarkeit, insbesondere der Fähigkeit zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke, wurden die Lipophilien bei einer Auswahl der Testverbindungen durch Bestimmung ihrer log P-Werte ermittelt. Neben dem Verfahren der potentiometrischen Titration wurde eine HPLC-Methode an einer RP-Phase verwendet.rnUm das Zytotoxizitätsprofil der synthetisierten Strukturen frühzeitig abschätzen zu können, wurde ein schnell durchführbares, zellbasiertes in vitro-Testsystem, der kommerziell erhältliche „Cell Proliferation Kit II (XTT-Test)“, eingesetzt. rnIm Rahmen von Positronen-Emissions-Tomographie-Experimenten an Ratten wurde eine Aussage bezüglich der Aufnahme und Verteilung eines radioaktiv markierten, hochaffinen Liganden an der Glycinbindungsstelle des NMDA-Rezeptors im Gehirn getroffen. Dabei wurden sowohl ein Carbonsäure-Derivat sowie der korrespondierende Ethylester dieser Testung unterworfen.rn

Oxidativer Stress als Modulator der NMDA-Rezeptorexpression auf zerebrovaskulären Endothelzellen

Oxidativer Stress in Form reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Exzitotoxizität durch supraphysiologische Konzentrationen des Neurotransmitters Glutamat sind nicht nur beteiligt an der Pathogenese vielzähliger neurodegenerativer Erkrankungen wie Schlaganfall, Hirntrauma, Alzheimer Demenz oder Multipler Sklerose, sondern spielen zudem eine Schlüsselrolle im dort beobachteten Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke. Glutamat führt durch Stimulation neuronaler und endothelialer NMDA-Rezeptoren zu einer Generierung von ROS. Nicht verfolgt worden war bisher, welche Auswirkungen ROS umgekehrt auch auf den NMDA-Rezeptor haben könnten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, ob und in welcher Weise die Exposition gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies einen Einfluss auf die Expression und Aktivierbarkeit von NMDA-Rezeptoren auf zerebrovaskulären Endothelzellen ausübt.rnEs konnte zunächst die Expression der funktionell obligaten NR-1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors auf der verwendeten Zelllinie b.End3 mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie gesichert werden. Ein Nachweis von mRNA für die Untereinheiten NR1 und NR2B, C und D erfolgte mittels RT-PCR. In der Analyse der replizierten RNA zeigten sich Hinweise für eine heterogene Komposition der exprimierten endothelialen NMDA-Rezeptoren.rnEs konnte weiter mit Hilfe der In-Cell-Western-Technik gezeigt werden, dass die Expression des NMDA-Rezeptors durch transiente Stimulation mit reaktiven Sauerstoffspezies im Sinne einer Heraufregulation moduliert werden kann. Die Stimulation der Zellen mit den reaktiven Sauerstoffspezies O2-, ONOO- und H2O2 führte dabei im Experiment zu einer deutlichen Zunahme der NR1-Expression, die spätestens nach 72 Stunden höchst signifikant war.rnUm zu überprüfen, welche Bedeutung diese Überexpression für die Integrität der Blut-Hirn-Schranke unter den exzitotoxischen Bedingungen hoher Glutamatkonzentrationen haben könnte, wurde mit Hilfe des ECIS-Systems („Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing“) die Impedanz ROS-präexponierter Endothelmonolayer gemessen. Auf Rezeptorstimulation mit dem spezifischen Agonisten NMDA reagierten die vorbehandelten Gruppen mit einem Abfall der Impedanz gegenüber der nicht vorbehandelten Kontrolle.rnrnDie vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass ROS in der Lage sind, funktionelle endotheliale NMDA-Rezeptoren zu induzieren und auf diesem Weg zu einem verstärkten Abfall der BHS-Integrität unter den Bedingungen exzitotoxischen und oxidativen Stresses führen. Dies stellt einen neuen Mechanismus zur Erklärung der Pathogenese des Blut-Hirn-Schrankenversagens dar.

Uptake of gold nanoparticles in microvascular endothelial cells

The physicochemical properties of nanoparticles make them suitable for biomedical applications. Due to their ‘straight-forward’ synthesis, their known biocompatibility, their strong optical properties, their ability for targeted drug delivery and their uptake potential into cells gold nanoparticles are highly interesting for biomedical applications. In particular, the therapy of brain diseases (neurodegenerative diseases, ischemic stroke) is a challenge for contemporary medicine and gold nanoparticles are currently being studied in the hope of improving drug delivery to the brain.rnIn this thesis three major conclusions from the generated data are emphasized.rn1. After improvement of the isolation protocol and culture conditions, the formation of a monolayer of porcine brain endothelial cells on transwell filters lead to a reproducible and tight in vitro monoculture which exhibited in vivo blood brain barrier (BBB) characteristics. The transport of nanoparticles across the barrier was studied using this model.rn2. Although gold nanoparticles are known to be relatively bioinert, contaminants of the nanoparticle synthesis (i.e. CTAB or sodium citrate) increased the cytotoxicity of gold nanoparticles, as shown by various publications. The results presented in this thesis demonstrate that contaminants of the nanoparticle synthesis such as sodium citrate increased the cytotoxicity of the gold nanoparticles in endothelial cells but in a more dramatic manner in epithelial cells. Considering the increased uptake of these particles by epithelial cells compared to endothelial cells it was demonstrated that the observed decrease of cell viability appeared to be related to the amount of internalized gold nanoparticles in combination with the presence of the contaminant.rn3. Systematically synthesized gold nanoparticles of different sizes with a variety of surface modifications (different chemical groups and net charges) were investigated for their uptake behaviour and functional impairment of endothelial cells, one of the major cell types making up the BBB. The targeting of these different nanoparticles to endothelial cells from different parts of the body was investigated in a comparative study of human microvascular dermal and cerebral endothelial cells. In these experiments it was demonstrated that different properties of the nanoparticles resulted in a variety of uptake patterns into cells. Positively charged gold nanoparticles were internalized in high amounts, while PEGylated nanoparticles were not taken up by both cell types. Differences in the uptake behavior were also demonstrated for neutrally charged particles of different sizes, coated with hydroxypropylamine or glucosamine. Endothelial cells of the brain specifically internalized 35nm neutrally charged hydroxypropylamine-coated gold nanoparticles in larger amounts compared to dermal microvascular endothelial cells, indicating a "targeting" for brain endothelial cells. Co-localization studies with flotillin-1 and flotillin-2 showed that the gold nanoparticles were internalized by endocytotic pathways. Furthermore, these nanoparticles exhibited transcytosis across the endothelial cell barrier in an in vitro BBB model generated with primary porcine brain endothelial cells (1.). In conclusion, gold nanoparticles with different sizes and surface characteristics showed different uptake patterns in dermal and cerebral endothelial cells. In addition, gold nanoparticles with a specific size and defined surface modification were able to cross the blood-brain barrier in a porcine in vitro model and may thus be useful for controlled delivery of drugs to the brain.

Synthese und präklinische Evaluation von neuen antioxidativen Substanzen zur Neuroprotektion

Oxidativer Stress ist seit über 25 Jahren als ein Charakteristikum vieler pathologischer Prozesse bekannt. Helmut Sies beschrieb bereits in den 1980er Jahren oxidativen Stress als Störung in der prooxidativ – antioxidativen Balance zugunsten der prooxidativen Seite, wodurch es potentiell zu Schäden in verschiedenen Geweben kommt. Oxidativer Stress tritt sowohl bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und zerebraler Ischämie, bei peripheren Erkrankungen wie Arteriosklerose, als auch beim Alterungsprozess per se auf und wird als Ursache oder zumindest als ein krankheitsfördernder Faktor diskutiert. Die in in vitro-Experimenten als vielversprechend antioxidativ getesteten Substanzen (meist phenolhaltig) ergaben in mehreren klinischen Studien keinen signifikanten Vorteil. Um die Ursachen dieser Ergebnisse näher zu analysieren, wurde in der vorliegenden Arbeit auf Basis des cytoprotektiven Phenothiazins, einem aromatischen trizyklischen Amin, der Einfluss von verschiedenen Substituenten im Hinblick auf Lipophilie, Radikalstabilisierung und Löslichkeit des Moleküls chemisch vorhergesagt. Anhand dieser in silicio Struktur-Wirkungs-Beziehung wurden anschließend neue Modellsubstanzen synthetisiert, welche sich systematisch in den drei zuvor genannten Parametern unterschieden. Dies wurde durch Substitution von unterschiedlich langen Fettsäureketten, von löslichkeitsbeeinflussenden funktionellen Gruppen, oder durch Anellierung zusätzlicher aromatischer Ringe erreicht. In den folgenden Versuchen zu antioxidativer Kapazität, zellulärem Überleben, Lipidperoxidation und Proteinoxidation zeigte sich, dass mit gesteigerter Stabilität der korrespondierenden Radikale und mit wachsender Lipophilie die antioxidativ cytoprotektive Aktivität der neuen Derivate bis zu einer gewissen Grenze (logP ≈ 7) signifikant zunahm; über diesen Wert hinaus sank die Effektivität wieder ab. Benzanellierte Phenothiazine entwickelten mit EC50-Werten von ungefähr 8-10 nM die höchste mittlere effektive Wirkkonzentration in oxidativ geschädigten, klonalen hippocampalen Neuronen (HT-22 Zellen). Dies entspricht einer etwa 20-fachen Verbesserung gegenüber α-Tocopherol, welches bisher als bestes natürliches lipophiles Antioxidans angesehen wurde. Im Vergleich zu Phenothiazin erreichen die neuen Antioxidantien immerhin eine höhere Effektivität um den Faktor 4. Folglich sind es sowohl Aspekte der Löslichkeit und der Distribution, welche die Potenz der gegenwärtigen Antioxidantien limitieren als auch Aspekte der Radikalstabilisierung, die Einfluss auf die primäre Wirksamkeit nehmen. Dieses Wissen sollte beim zukünftigen Design neuer, antioxidativ potenter Moleküle im Hinblick auf ihren langfristigen Einsatz bei neurodegenerativen Erkrankungen von Nutzen sein.

Gene therapy for a novel mouse model of Canavan disease

Canavan disease (CD) is a rare leukodystrophy caused by loss-of-function mutations in the gene encoding aspartoacylase (ASPA), an oligodendrocyte-enriched enzyme. It is characterised by the accumulation of the ASPA substrate N-acetylaspartate (NAA) in brain, blood and urine, leading to a spongiform vacuolisation of the brain, severe motoric and cognitive impairments and premature death. To date, no therapy is available due to the lack of a gene-transfer system allowing transgene expression in oligodendrocytes (OLs) and the restoration of the missing enzyme. Hence, the aim of this study was to establish a novel gene-transfer system and its preclinical evaluation in a CD animal model.rnIn the first part of this thesis, a novel ASPA mouse mutant was generated. A βgeo cassette (including the genes encoding β-galactosidase and neomycin) flanked by frt sites was inserted into intron 1 of the intact aspa gene. Additionally, exon 2 was flanked by loxP sites for optional conditional deletion of the targeted locus. The resulting ASPA-deficient aspalacZ/lacZ-mouse was found to be an accurate model of CD and an important tool to identify novel aspects of its complex pathology. Homozygous mutants showed a CD-like histopathology, neurological impairment, behavioural deficits as well as a reduced body weight. Additionally, MRI data revealed changes in brain metabolite composition. rnRecombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors have become a versatile tool for gene transfer to the central nervous system because they are efficient, non-toxic and replication-deficient. Based on the natural neurotropism of AAV vectors, AAV-based gene delivery has entered the clinics for the treatment of neurodegenerative diseases. However, the lack of AAV vectors with oligodendroglial tropism has precluded gene therapy for leukodystrophies. In the second part of this work, it was shown that the transduction profile of established AAV serotypes can be targeted towards OLs in a transcriptional approach, using the oligodendrocyte-specific myelin basic protein (MBP) promoter to drive transgene expression in OLs.rnIn the last part of this work, the therapeutic efficacy of AAV-mediated aspa gene transfer to OLs of juvenile aspalacZ/lacZ mice was evaluated. AAV-aspa injections into multiple sites of the brain parenchyma resulted in transduction of OLs in the grey and white matter throughout the brain. Histological abnormalities in the brain of ASPA-deficient mice were ameliorated and accompanied by a reduction of NAA levels. Furthermore, the treatment resulted in normalisation of body weight, motor function and nest-building behaviour. These data provide a proof-of-concept for a successful gene therapy of Canavan disease. This might pave the way towards translation into clinical application and serve as the basis for the genetic treatment of other leukodystrophies.

Untersuchungen zur Wirkung des Ginkgo-biloba-Extraktes EGb 761 auf die Proteinaggregation in der Huntington-Krankheit

Der Ginkgo biloba-Extrakt EGb 761 besteht aus einer Reihe pharmakologisch wirksamer Substanzen, welche gut beschriebene Wirkungen auf verschiedene potentiell zytoprotektive Signalwege ausüben und u.a. antioxidative Wirksamkeit haben. Folglich wurde EGb 761 bisher als eine natürliche Behandlung bei neurodegenerativen Erkrankungen mit zellulärem oxidativen Stress angewendet, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD). Aufgrund von vielen gemeinsamen Merkmalen zwischen der AD und der Huntington-Krankheit (HD) wurde vermutet, dass EGb 761 eventuell auch positive Wirksamkeit bei der HD aufweisen könnte. rnDie Neuropathologie der HD wird durch pathologische Verlängerung an Glutamin-Wiederholungen im Huntingtin-Protein (polyQ-Protein) verursacht, wodurch es zu Fehlfaltungen im Protein kommt und hierdurch der proteasomale Abbau aberranter Proteine erschwert wird. Somit sollten in der vorliegenden Arbeit die EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität und die Proteinaggregation in zellulären Modellen der HD untersucht werden. rnWie die ersten Untersuchungen in nativen HEK293-Zellen ergaben, bewirkte die Behandlung der Zellen mit EGb 761 eine Steigerung der basalen Proteasom-Aktivität sowie des proteasomalen Proteinabbaus und erhöhte die Transkription proteasomaler Gene. Hieraus ergaben sich Untersuchungen in Zellen mit Expressionen pathologischer Varianten von polyQ-Proteinen als zelluläre Modelle der HD. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteine eine verminderte zelluläre Proteasom-Aktivität bewirkte. Interessanterweise verursachte EGb 761 eine Abmilderung der pathologisch-induzierten verminderten Proteasom-Aktivität, in dem die EGb 761-Behandlung der Zellen zu einer erhöhten Proteasom-Aktivität, einem verbesserten proteasomalen Proteinabbau, sowie zu einer erhöhten Transkription proteasomaler Gene führte. Da diese EGb 761-Effekte unabhängig von der Expression aberranter polyQ-Proteine waren, demonstrierten diese Ergebnisse eine allgemeine EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität. Anhand dieser Ergebnisse sollten anschließend weitere Untersuchungen mit zellulären Modellen der HD die genau Wirkung von EGb 761 auf die Degradation von abnormal verlängerten polyQ-Proteinen sowie auf die Bildung von polyQ-Aggregaten klären. rnHier konnte gezeigt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteinen zu einer Akkumulation von SDS-resistenten bzw. SDS-unlöslichen, aggregierten polyQ-Proteinen führte, sowie die Bildung von sichtbaren polyQ-Aggregaten in Zellen bewirkte. Hierbei verursachte eine EGb 761-Behandlung der Zellen eine signifikante Verminderung im Gehalt an SDS-resistenten polyQ-Proteinen sowie eine Reduzierung von Aggregat-tragenden Zellen. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine pharmakologische Inhibition des Proteasoms in EGb 761-behandelten Zellen, den Gehalt an SDS-unlöslichen polyQ-Proteinaggregate wieder erhöhte und somit den Effekt von EGb 761 aufhob. Folglich zeigten diese Ergebnisse, dass die EGb 761-induzierte Reduzierung der polyQ-Proteinaggregate durch einen effizienteren proteasomalen Abbau von fehlgefalteten, aberranten polyQ-Proteinen bewirkte wurde. rnAufbauend auf diesen Ergebnissen wurde eine experimentell-therapeutische Anwendung von EGb 761 in Modellen der HD in vitro und in vivo überprüft und hierzu primäre humane Fibroblasten sowie transgene C. elegans Würmer mit Expressionen aberranter polyQ-Proteine untersucht. Interessanterweise konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass die EGb 761-Behandlung auch hier eine Reduzierung von SDS-unlöslichen polyQ-Proteinen bewirkte und zudem eine Reduzierung des pathologisch erhöhten Gehalts an Polyubiquitin-Proteinen bewirkte. Folglich wurde auch hier vermutet, dass EGb 761 einen verbesserten proteasomalen Abbau von polyQ-Proteinen induzierte und dies eine Verminderung der polyQ-Proteinaggregate verursachte. Darüber hinaus führte die EGb 761-Behandlung von seneszenten Fibroblasten zur Reduzierung von altersabhängig erhöhten Mengen von polyQ-Aggregaten, wodurch ein therapeutischer Effekt auf den proteasomalen Abbau der polyQ-Proteine verdeutlicht wurde. Zusätzlich konnte in polyQ-transgenen C. elegans demonstriert werden, dass eine EGb 761-Behandlung die Abmilderung eines typischen pathologischen Phänotyps bewirkte, indem eine polyQ-induzierte verminderte Motilität der Nematoden verbessert wurde und hierdurch eine positive EGb 761-Wirkung auf die Pathologie der HD in vivo dargestellt wurde. rnZusammenfassend konnten in dieser Arbeit neue Wirkungen von EGb 761 in der HD demonstriert werden. Hierbei wurde gezeigt, dass EGb 761 die Aggregation von pathogenen aberranten polyQ-Proteinen in vitro und in vivo reduziert, indem eine effizientere Degradation von polyQ-Proteinen erfolgt. Somit könnte diese Wirkungen von EGb 761 eine potentiell therapeutische Anwendung in der HD und ähnliche neurodegenerativen Erkrankungen darstellen.

Der Einfluss des Endocannabinoidsystems auf die Alzheimer Pathologie

Die Alzheimer Krankheit ist eine der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, deren Ursache, abgesehen von einem geringen Prozentsatz vererbter Formen, bisher nicht bekannt ist. Ein wichtiges Ziel der Grundlagenforschung liegt derzeit in der Modulation der APP-spaltenden Enzyme. Durch die Modulation dieser Enzyme könnten weniger schädigende Amyloid β-Peptide entstehen. Die Aktivität des ECS ist in vielen neurodegenerativen Krankheiten verändert. Protektive Eigenschaften der Cannabinoidrezeptoren wurden bei der Alzheimer Krankheit beschrieben. Deshalb sollte in dieser Arbeit der Einfluss des ECS auf die Pathogenese der Alzheimer Erkrankung untersucht werden. In Zellkultursystemen wurde der Einfluss von Cannabinoiden auf die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins analysiert. Durch Inkubation der Zellen mit CB1-Rezeptor Agonisten konnte die APP-Prozessierung zugunsten von sAPPα moduliert werden. Gleichzeitig führte die Inkubation mit Cannabinoiden zur reduzierten Amyloid β Menge im Medium der Zellen. In dieser Arbeit konnte die APP-Prozessierung durch die Aktivierung des CB1-Rezeptors zugunsten des nicht-amyloiden Wegs moduliert werden.rnIn einem Tiermodell wurde der Einfluss des CB1-Rezeptors in APP23 transgenen Mäusen untersucht. Der Knockout des CB1-Rezeptors führte in APP23 transgenen Tieren zu weitreichenden biochemischen Veränderungen. APP23/CB1-/--Tiere zeigten eine erhöhte Mortalität und ein sehr geringes Durchschnittsgewicht. Im Vergleich zu APP23/CB1+/+-Tieren führte der CB1-Rezeptor Knockout zur Reduktion der APP-Expression und dessen Prozessierungsprodukten. In den histologischen Untersuchungen wurde eine reduzierte Anzahl an amyloiden Plaques, sowie eine reduzierte Neuroinflammation ermittelt. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass der CB1-Rezeptor einen möglichen regulatorischen Einfluss auf die Expression und Prozessierung von APP ausübt. Die Tiere mit der geringsten Plaque-Menge (APP23/CB1-/-) und einer reduzierten Prozessierung von sAPPα- und den CTFs zeigten die schlechteste Lernleistung im Morris Water-Maze. Deshalb müssen andere Faktoren (z.B. die Degradation der Myelinschicht) für die schlechte Lernleistung verantwortlich sein. Mit einem zweiten Tiermodell könnte in CB1-Knockout Mäusen durch den viral-vermittelten Gentransfer eine mögliche Toxizität von Aβ Peptiden untersucht werden. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen, dass der CB1-Rezeptor an der Regulation der APP-Prozessierung beteiligt ist und zu proteinbiochemischen Veränderungen im Zell- und Tiermodell führt.

Untersuchung zur endogenen Bildung von oxidativen DNA-Schäden in vivo und in vitro

In dieser Arbeit sollte der Einfluss einer Überproduktion von humaner Superoxiddismutase 1 (hSOD1) auf die Spiegel der DNA-Schäden in verschiedenen Geweben von transgenen Mäusen untersucht werden. Tiere die eine Defizienz des Ogg1- und Csb- Proteins aufweisen und deshalb oxidative Purinmodifikationen nicht oder nur schwer reparieren können, akkumulieren 8-oxoG im Laufe ihres Lebens (Osterod, et al. 2001). Aus diesem Grund sind diese ein gutes Modell, um protektive Eigenschaften von Antioxidantien wie z.B. Substanzen oder Enzymen zu untersuchen. Fusser, et al. 2011 konnten beispielsweise zeigen, dass das pflanzliche Polyphenol Resveratrol die endogenen Spiegel an 8-oxoG sowie die spontanen Mutatiosraten im Lac I - Gen senken kann. Um den Einfluss von hSOD1 in vivo zu untersuchen, wurden in zwei Zuchtschritten 4 Mausgenotypen generiert, nämlich (Csb -/- Ogg1 -/- und Csb +/- Ogg1 +/- Mäuse jeweils mit ohne hSOD1 Überexpression). Diese wurden in verschiedenen Altersstufen auf die Basalspiegel an oxidativen Schäden (Einzelstrangbrüche und Fpg-sensitive Läsionen) in der Leber, der Niere und der Milz untersucht. Die Genotypen wurden zunächst charakterisiert und die hSOD1-Überexpression mittels qRT-PCR, Western Blot und Enzymaktivitätsbestimmung verifiziert. Es konnte an diesen Tieren erstmalig gezeigt werden, dass SOD die Generierung von DNA-Schäden in vivo mit zunehmendem Alter der Tiere senkt und dass deshalb Superoxid eine der reaktiven Sauerstoffspezies ist, die unter physiologischen Bedingungen für die DNA-Schäden verantwortlich ist. Außerdem kann ein möglicher toxischer Effekt der Überproduktion von SOD ausgeschlossen werden. Erhöhte Spiegel an oxidativen DNA-Schäden durch womöglich erhöhte Spiegel an H2O2 konnten in dieser Studie nicht beobachtet werden. Eine Messung der Genexpression anderer antioxidativer Enzyme wie Katalase, SOD2 und SOD3, GPX oder HO1 sind an diesem Effekt nicht beteiligt. Auch konnte kein Einfluss des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors Nrf2 gezeigt werden. rnUm mögliche Quellen der für die oxidativ gebildeten DNA-Schäden verantwortlichen ROS zu identifizieren, wurde der Einfluss des Dopaminstoffwechsels untersucht. Während des Dopaminmetabolismus werden intrazellulär Reaktive Sauerstoffspezies (H2O2 und O2.-) gebildet und tragen sehr wahrscheinlich zur Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson bei. In dem gängigen Parkinson-Zellkulturmodell SH-SY5Y konnte keine Erhöhung von oxidativen Schäden in nukleärer DNA nach Dopaminbehandlung nachgewiesen werden. Eine Überexpression der Dopaminmetabolisierenden Enzyme MAO-A und MAO-B zeigen bei niedrigen Dosen Dopamin eine leichte jedoch nicht signifikante Erhöhung der Fpg-sensitiven Modifikationen. Die Überproduktion des Dopamintransporters zeigte keinen Effekt nach Dopaminzugabe. Es kann geschlussfolgert werden, dass durch erhöhte MAO-A und MAO-B endogen ROS gebildet werden, die die Bildung Fpg-sensitiver Läsionen hervorrufen. Bei hohen Dosen und langer Inkubationszeit steht die Dopaminautoxidation, anschließende Neuromelaninbildung und als Konsequenz Apoptose im Vordergrund.rn

Targeting neuronal populations by AAV-mediated gene transfer for studying the endocannabinoid system

The cannabinoid type 1 (CB1) receptor is involved in a plethora of physiological functions and heterogeneously expressed on different neuronal populations. Several conditional loss-of-function studies revealed distinct effects of CB1 receptor signaling on glutamatergic and GABAergic neurons, respectively. To gain a comprehensive picture of CB1 receptor-mediated effects, the present study aimed at developing a gain-of-function approach, which complements conditional loss-of-function studies. Therefore, adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery and Cre-mediated recombination were combined to recreate an innovative method, which ensures region- and cell type-specific transgene expression in the brain. This method was used to overexpress the CB1 receptor in glutamatergic pyramidal neurons of the mouse hippocampus. Enhanced CB1 receptor activity at glutamatergic terminals caused impairment in hippocampus-dependent memory performance. On the other hand, elevated CB1 receptor levels provoked an increased protection against kainic acid-induced seizures and against excitotoxic neuronal cell death. This finding indicates the protective role of CB1 receptor on hippocampal glutamatergic terminals as a molecular stout guard in controlling excessive neuronal network activity. Hence, CB1 receptor on glutamatergic hippocampal neurons may represent a target for novel agents to restrain excitotoxic events and to treat neurodegenerative diseases. Endocannabinoid synthesizing and degrading enzymes tightly regulate endocannabinoid signaling, and thus, represent a promising therapeutic target. To further elucidate the precise function of the 2-AG degrading enzyme monoacylglycerol lipase (MAGL), MAGL was overexpressed specifically in hippocampal pyramidal neurons. This genetic modification resulted in highly increased MAGL activity accompanied by a 50 % decrease in 2-AG levels without affecting the content of arachidonic acid and anandamide. Elevated MAGL protein levels at glutamatergic terminals eliminated depolarization-induced suppression of excitation (DSE), while depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) was unchanged. This result indicates that the on-demand availability of the endocannabinoid 2-AG is crucial for short-term plasticity at glutamatergic synapses in the hippocampus. Mice overexpressing MAGL exhibited elevated corticosterone levels under basal conditions and an increase in anxiety-like behavior, but surprisingly, showed no changes in aversive memory formation and in seizure susceptibility. This finding suggests that 2 AG-mediated hippocampal DSE is essential for adapting to aversive situations, but is not required to form aversive memory and to protect against kainic acid-induced seizures. Thus, specific inhibition of MAGL expressed in hippocampal pyramidal neurons may represent a potential treatment strategy for anxiety and stress disorders. Finally, the method of AAV-mediated cell type-specific transgene expression was advanced to allow drug-inducible and reversible transgene expression. Therefore, elements of the tetracycline-controlled gene expression system were incorporated in our “conditional” AAV vector. This approach showed that transgene expression is switched on after drug application and that background activity in the uninduced state was only detectable in scattered cells of the hippocampus. Thus, this AAV vector will proof useful for future research applications and gene therapy approaches.

Substratversorgung von NO-Synthasen

Resultate dieser Arbeit zeigen, dass endotheliale und neuronale NO-Synthasen (eNOS und nNOS) ihr Substrat Arginin nicht ausschließlich aus extrazellulären, sondern auch aus intrazellulären Quellen beziehen. Das Substrat aus den intrazellulären Quellen scheint nicht über Membrantransporter in den Extrazellulärraum gelangen zu können. Dies deutet darauf hin, dass eine enge Assoziation der Arginin-bereitstellenden Enzyme mit eNOS bzw. nNOS vorliegen könnte. Dadurch würde das durch diese Enzyme generierte Arginin direkt an die NOS weitergereicht und nicht über Transporter gegen andere basische Aminosäuren (AS) im Extrazellulärraum ausgetauscht werden. Eine intrazelluläre Substrat-Quelle besteht aus dem so genannten „Recycling“, der Umwandlung des bei der NO-Synthese entstehenden Citrullins in Arginin. Eine Kopplung von Arginin-bereitstellenden „Recycling“-Enzymen mit NOS wird in Endothelzellen und teilweise auch in TGW-nu-I Neuroblastomzellen beobachtet, nicht jedoch in A673 Neuroepitheliomzellen. Die Kopplung scheint daher vom Zelltyp abhängig zu sein. Das zur Arginin-Regeneration benötigte Citrullin kann allen untersuchten Zellen durch den Austausch mit spezifischen neutralen AS, die ausschließlich zum Substratprofil des System N Transporters SN1 passen, entzogen werden. Die Anwesenheit von SN1-Substraten im Extrazellulärraum führt daher indirekt zu einer Depletion der Recycling-Quelle. SN1 mRNA ist in allen untersuchten Zellen nachweisbar. Aus Protein-Abbau stammendes Arginin stellt den zweiten Teil der intrazellulären Arginin-Quelle dar. Dieser ist in allen untersuchten eNOS- oder nNOS exprimierenden Zellen vorhanden. Das Arginin stammt dabei sowohl aus lysosomalem als auch proteasomalen Proteinabbau, wie der Einsatz spezifischer Inhibitoren zeigt. Extrazelluläres Histidin (aber keine andere Aminosäure) kann diese Arginin-Quelle depletieren. Wir vermuten deshalb, dass Histidin über den Peptid-Histidin-Transporter PHT1, der in allen untersuchten Zellen stark exprimiert ist, gegen die durch lysosomalen und proteasomalen Proteinabbau entstehenden Arginin-haltigen Di- und Tripeptide ausgetauscht wird. Der wichtigste endogene NOS-Inhibitor, asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), ein Marker für endotheliale Dysfunktion und Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, stammt ebenfalls aus Proteinabbau. Die Verfügbarkeit dieser intrazellulären Arginin-Quelle wird deshalb stark vom Methylierungsgrad des Arginins in den abgebauten Proteinen abhängen. Eine lokale ADMA-Anreicherung könnte eine Erklärung für das Arginin-Paradox sein, der unter pathophysiologischen Bedingungen beobachteten Verminderung der endothelialen NO-Synthese bei anscheinend ausreichenden intrazellulären Argininkonzentrationen. Da auch in neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, ADMA eine Rolle zu spielen scheint, könnte das Arginin-Paradox auch für die nNOS-vermittelte NO-Synthese von Bedeutung sein. Die Resultate demonstrieren, dass die Substratversorgung der beiden NOS-Isoformen nicht ausschließlich von kationischen Aminosäuretransportern abhängig ist, sondern auch von Transportern für neutrale Aminosäuren und Peptide, und außerdem von Arginin-bereitstellenden Enzymen. Der jeweilige Beitrag der verschiedenen Arginin-Quellen zur Substratversorgung der NOS ist daher abhängig vom Anteil der jeweiligen Aminosäuren und Peptide in der extrazellulären Flüssigkeit.