Funktionelle Analyse der Gliazellwanderung im Drosophila-Embryo

Gliazellen kommen in allen höheren Organismen vor und sind sowohl für die korrekte Entwicklung, als auch für die Funktionalität des adulten Nervensystems unerlässlich. Eine der mannigfachen Funktionen dieses Zelltyps ist die Umhüllung von Axonen im zentralen und peripheren Nervensystem (ZNS und PNS). Um eine vollständige Umhüllung zu gewährleisten, wandern Gliazellen während der Neurogenese zum Teil über enorme Distanzen von ihrem Entstehungsort aus. Dies trifft insbesondere auf die Gliazellen zu, durch deren Membranausläufer die distalen Axonbereiche der peripheren Nerven isoliert werden.rnIn dieser Arbeit wurde die Migration von Gliazellen anhand des Modelorganismus Drosophila untersucht. Ein besonderes Interesse galt dabei der Wanderung einer distinkten Population von Gliazellen, den sogenannten embryonalen Peripheren Gliazellen (ePG). Die ePGs werden überwiegend im sich entwickelnden ventralen Bauchmark geboren und wandern anschließend entlang der peripheren Nerventrakte nach dorsal aus, um diese bis zum Ende der Embryogenese zu umhüllen und dadurch die gliale Blut-Nerv-Schranke zu etablieren. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, neue Faktoren bzw. Mechanismen aufzudecken, durch welche die Migration der ePGs reguliert wird. Dazu wurde zunächst der wildtypische Verlauf ihrer Wanderung detailliert analysiert. Es stellte sich heraus, dass in jedem abdominalen Hemisegment eine invariante Anzahl von 12 ePGs von distinkten neuralen Vorläuferzellen generiert wird, die individuelle Identitäten besitzen und mittels molekularer Marker auf Einzelzellebene identifiziert werden können. Basierend auf der charakteristischen Lage der Zellen erfolgte die Etablierung einer neuen, konsistenten Nomenklatur für sämtliche ePGs. Darüber hinaus offenbarten in vivo Migrationsanalysen, dass die Wanderung individueller ePGs stereotyp verläuft und demzufolge weitestgehend prädeterminiert ist. Die genaue Kenntnis der wildtypischen ePG Migration auf Einzelzellebene diente anschließend als Grundlage für detaillierte Mutantenanalysen. Anhand derer konnte für den ebenfalls als molekularen Marker verwendeten Transkriptionsfaktor Castor eine Funktion als zellspezifische Determinante für die korrekte Spezifizierung der ePG6 und ePG8 nachgewiesen werden, dessen Verlust in einem signifikanten Migrationsdefekt dieser beiden ePGs resultiert. Des Weiteren konnte mit Netrin (NetB) der erste diffusible und richtungsweisende Faktor für die Migration von ePGs enthüllt werden, der in Interaktion mit dem Rezeptor Uncoordinated5 speziell die Wanderung der ePG6 und ePG8 leitet. Die von den übrigen Gliazellen unabhängige Navigation der ePG6 und ePG8 belegt, dass zumindest die Migration von Gruppen der ePGs durch unterschiedliche Mechanismen kontrolliert wird, was durch die Resultate der durchgeführten Ablationsexperimente bestätigt wird. rnFerner konnte gezeigt werden, dass während der frühen Gliogenese eine zuvor unbekannte, von Neuroblasten bereitgestellte Netrinquelle an der initialen Wegfindung der Longitudinalen Gliazellen (eine Population Neuropil-assoziierter Gliazellen im ZNS) beteiligt ist. In diesem Kontext erfolgt die Signaldetektion bereits in deren Vorläuferzelle, dem Longitudinalen Glioblasten, zellautonom über den Rezeptor Frazzled. rnFür künftige Mutantenscreens zur Identifizierung weiterer an der Migration der ePGs beteiligter Faktoren stellt die in dieser Arbeit präsentierte detaillierte Beschreibung eine wichtige Grundlage dar. Speziell in Kombination mit den vorgestellten molekularen Markern liefert sie die Voraussetzung dafür, individuelle ePGs auch im mutanten Hintergrund zu erfassen, wodurch selbst subtile Phänotypen überhaupt erst detektiert und auf Einzelzellebene analysiert werden können. Aufgrund der aufgezeigten voneinander unabhängigen Wegfindung, erscheinen Mutantenanalysen ohne derartige Möglichkeiten wenig erfolgversprechend, da Mutationen vermutlich mehrheitlich die Migration einzelner oder weniger ePGs beeinträchtigen. Letzten Endes wird somit die Aussicht verbessert, weitere neuartige Migrationsfaktoren im Modellorganismus Drosophila zu entschlüsseln, die gegebenenfalls bis hin zu höheren Organismen konserviert sind und folglich zum Verständnis der Gliazellwanderung in Vertebraten beitragen.

Antigen-dependent induction of a CD40 signal in peripheral B cells

Monoclonal antibodies have emerged as one of the most promising therapeutics in oncology over the last decades. The generation of fully human tumorantigen-specific antibodies suitable for anti-tumor therapy is laborious and difficult to achieve. Autoreactive B cells expressing those antibodies are detectable in cancer patients and represent a suitable source for human antibodies. However, the isolation and cultivation of this cell type is challenging. A novel method was established to identify antigen-specific B cells. The method is based on the conversion of the antigen independent CD40 signal into an antigen-specific one. For that, the artificial fusion proteins ABCos1 and ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) were generated, which consist of an extracellular association-domain derived from the constant region of the human immunoglobulin (Ig) G1, a transmembrane fragment and an intracellular signal transducer domain derived of the cytoplasmic domain of the human CD40 receptor. By the association with endogenous Ig molecules the heterodimeric complex allows the antigen-specific stimulation of both the BCR and CD40. In this work the ability of the ABCos constructs to associate with endogenous IgG molecules was shown. Moreover, crosslinking of ABCos stimulates the activation of NF-κB in HEK293-lucNifty and induces proliferation in B cells. The stimulation of ABCos in transfected B cells results in an activation pattern different from that induced by the conventional CD40 signal. ABCos activated B cells show a mainly IgG isotype specific activation of memory B cells and are characterized by high proliferation and the differentiation into plasma cells. To validate the approach a model system was conducted: B cells were transfected with IVT-RNA encoding for anti-Plac1 B cell receptor (antigen-specific BCR), ABCos or both. The stimulation with the BCR specific Plac1 peptide induces proliferation only in the cotransfected B cell population. Moreover, we tested the method in human IgG+ memory B cells from CMV infected blood donors, in which the stimulation of ABCos transfected B cells with a CMV peptide induces antigen-specific expansion. These findings show that challenging ABCos transfected B cells with a specific antigen results in the activation and expansion of antigen-specific B cells and not only allows the identification but also cultivation of these B cells. The described method will help to identify antigen-specific B cells and can be used to characterize (tumor) autoantigen-specific B cells and allows the generation of fully human antibodies that can be used as diagnostic tool as well as in cancer therapy.

Comparative functional analysis of factors controlling glial differentiation in Drosophila and mouse

The present study is a comparative functional analysis of three factors controlling glial differentiation in mouse (Fyn Src kinase, hnRNPF/H and NG2) and their homologues in Drosophila (Src42A and 64B, Glorund and Kon-tiki (Kon)). In Drosophila, mutations in any of these genes were not associated with major embryonic neurodevelopmental phenotypes. Src kinases and Glorund were shown to be ubiquitously expressed, whereas kon mRNA showed selective expression in muscles as well as in central and peripheral glia. Kon was also shown to be expressed in L3 larvae with high levels of protein accumulation at the neuromuscular junction (NMJ) and in muscles in the form of speckles. Knockdown of kon in glia resulted in NMJ phenotypes, mainly characterized by a significant increase in bouton number and a reduction in α-Konecto staining intensity at the NMJ. From the three glial layers ensheathing the peripheral nervous system, subperineurial glial showed to be the one contributing the most to kon knockdown dependent NMJ phenotypes, while perineurial glia only had a minor role. The knockdown of kon in glia also showed to affect Glutamate receptor subunit (α-GluRIIA) clustering in the postsynapse, same as microtubule arrangement in the presynapse, as seen by α-Futsch pattern interruptions and alterations. kon knockdown in glia also resulted in impaired axonal transport, as seen by the accumulation of Bruchpilot-positive vesicles along the nerves, abnormal formation of neuronal derived protrusions and swellings, filled with vacuole-like structures. Glia number along the peripheral nerves is also reduced as consequence of kon knockdown. Muscle derived Kon was shown to accumulate at the NMJ and play a role in bouton consolidation and to interfere with phagocytosis of ghost boutons. NMJ bouton and branch number was also significantly increased in Kon overexpression in glia. The overexpression of Kon in glia also resulted in a massive elongation of the ventral nerve cord, which served in a suppressor screen to identify intracellular interaction partners of Kon in glia. It was shown that Kon is processed in glia and preliminary results indicate that the metalloendopeptidase Kuzbanian (the fly homologue of ADAM10) may play a role in the shedding of Konecto. In the present work, Kon is shown as a multifunctional gene with various roles in glia-neuron and glia-neuron-muscle interaction.