Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig für viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise maßgeblich an der frühen Kondensation und Bildung des Knorpels und später an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs können ektopisch Knochenbildung auslösen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge lässt auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schließen. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten führt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-Mäuse mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese Mäuse wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verkürzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei prähypertrophe und hypertrophe Zone gleichermaßen betroffen waren. Dieser Phänotyp war verstärkt in Mäusen mit zusätzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte anhand von Röntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellulären Matrix waren nicht beeinträchtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden während der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene Mäuse generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gestört war. Zwei Mauslinien, die ähnliche Phänotypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-Mäuse sind kleiner als Wildtypmäuse und die Überexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten führt zu einer Verlängerung der Wachstumsfuge und einer verstärkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen Mäusen herunterreguliert, während Col10a1 und Ihh als Marker für die hypertrophe und prähypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies führt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen Mäusen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten überexprimiert wurde, konnte eine verlängerte prähypertrophe Zone, eine erhöhte Ihh-Expression, sowie eine verstärkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zusätzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Phänotyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeinträchtigung führte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben möglicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. Während der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verkürzung der Wachstumsfuge führte, kann man in Mäusen mit einer Störung der TGFbeta-Signalkaskade eine verstärkte Proliferation in einer daher verlängerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig für die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enthält, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.

Membrane properties and synaptic integration of identified neuronal populations in the developing rodent neocortex

In my PhD work I concentrated on three elementary questions that are essential to understand the interactions between the different neuronal cell populations in the developing neocortex. The questions regarded the identity of Cajal-Retzius (CR) cells, the ubiquitous expression of glycine receptors in all major cell populations of the immature neocortex, and the role of taurine in the modulation of immature neocortical network activity.rnTo unravel whether CR cells of different ontogenetic origin have divergent functions I investigated the electrophysiological properties of YFP+ (derived from the septum and borders of the pallium) and YFP− CR cells (derived from other neocortical origins). This study demonstrated that the passive and active electrophysiological properties as well as features of GABAergic PSCs and glutamatergic currents are similar between both CR cell populations. These findings suggest that CR cells of different origins most probably support similar functions within the neuronal networks of the early postnatal cerebral cortex.rnTo elucidate whether glycine receptors are expressed in all major cell populations of the developing neocortex I analyzed the functional expression of glycine receptors on subplate (SP) cells. Activation of glycine receptors by glycine, -alanine and taurine elicited membrane responses that could be blocked by the selective glycinergic antagonist strychnine. Pharmacological experiments suggest that SP cells express functional heteromeric glycine receptors that do not contain 1 subunits. The activation of glycine receptors by glycine and taurine induced a membrane depolarization, which mediated excitatory effects. Considering the key role of SP cells in immature cortical networks and the development of thalamocortical connections, this glycinergic excitation may influence the properties of early cortical networks and the formation of cortical circuits.rnIn the third part of my project I demonstrated that tonic taurine application induced a massive increase in the frequency of PSCs. Based on their reversal potential and their pharmacological properties these taurine-induced PSCs are exclusively transmitted via GABAA receptors to the pyramidal neurons, while both GABAA and glycine receptors were implicated in the generation of the presynaptic activity. Accordingly, whole-cell and cell-attached recordings from genetically labeled interneurons revealed the expression of glycine and GABAA receptors, which mediated an excitatory action on these cells. These findings suggest that low taurine concentrations can tonically activate exclusively GABAergic networks. The activity level maintained by this GABAergic activity in the immature nervous system may contribute to network properties and can facilitate the activity dependent formation of adequate synaptic projections.rnIn summary, the results of my studies complemented the knowledge about neuronal interactions in the immature neocortex and improve our understanding of cellular processes that guide neuronal development and thus shape the brain.rn

Einfluss der Aspiration auf die Zwei-Jahres-Mortalität von Patienten im prolongierten Weaning nach Dekanülierung

Diese Fall-Kontroll-Studie zeigt an einer Kohorte von 82 langzeitbeatmeten Patienten einer spezialisierten Weaningabteilung Aspiration bei 45 % der Patienten unmittelbar nach Entfernung der Trachealkanüle. Gesichert wurde die Aspiration durch schluckweises Trinken von mit Patentblau V gefärbten Wasser, das nach Durchtritt durch die Stimmlippen durch eine fiberoptische Untersuchung mit dem Bronchoskop durch das Tracheostoma mit dem Blick nach laryngeal nachzuweisen war. Diese Anzahl von 45 % stimmt gut mit den Daten aus der Literatur überein, die mit anderen Methoden zu ähnlichen Ergebnissen kommen. In dieser Arbeit gibt es keinen Vergleich gegen die fiberoptische Evaluation des Schluckens von nasal.rnIm Gegensatz zu anderen Arbeiten fanden wir keinen signifikanten Unterschied in der Länge der invasiven Beatmung, dem Alter oder der Komorbidität in beiden Gruppen. Während in anderen Arbeiten ein erhöhter CRP Wert ein Risikofaktor für eine erhöhte Mortalität war, konnten wir dies bei unseren Patienten nicht nachweisen.rnDurch insgesamt 21 Vergleiche von Alter, Geschlecht, Beatmungszeiten und klinischen Parametern konnte dargelegt werden, dass beide Gruppen mit und ohne Aspiration im Schluckversuch nahezu identisch sind. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Somit basieren die Überlebensraten beider Patientengruppen auf dem Merkmal Aspiration.rnDiese Doktorarbeit zeigt als eine der ersten Veröffentlichungen, dass langzeitbeatmete Patienten mit Aspiration nach Dekanülierung innerhalb der ersten 200 Tage ein erhöhtes Mortalitätsrisiko haben im Vergleich zur Patientengruppe ohne Aspiration.rnIm weiteren Verlauf liefen die beiden Überlebenskurven beider Patientengruppen nach ca. 720 Tagen zusammen. In zukünftigen Untersuchungen sind bei einer höheren Fallzahl Komorbiditäten sowie Einzelmerkmale des Allgemeinzustandes der Patienten, wie Stärke der Atemmuskulatur, Hustenstoß, Somnolenz, Fähigkeit des Stimmbandschlusses zu berücksichtigen.rnDas stärkere Auseinanderklaffen der Kurven binnen der ersten 200 Tage führen wir am ehesten auf eine allgemeine Schwäche der Patienten mit Aspiration und vermindertem Hustenstoß bei verminderter Kraft der Atemmuskulatur zurück, wobei Somnolenz, Konzentrationsfähigkeit, Kooperationsfähigkeit und Stimmbandschluss auch eine wesentliche Rolle spielen könnten. Die CRP-Werte deuten nicht darauf hin, dass ein pneumonisches Geschehen einen direkten Einfluss auf die Überlebenskurven hat.rnDysphagie und Aspiration bei langzeitbeatmeten, tracheotomierten Patienten sind weiterhin ein zu wenig untersuchtes Gebiet. Es gibt bislang keine Leitlinien zur Diagnostik und Therapie dieser häufigen Komplikation, deren optimale Diagnose und Behandlung weiterhin unklar bleibt. Logopädische Begleitung der Patienten auf der Beatmungsstation scheint uns entscheidend. Das beste therapeutische Vorgehen bezüglich Kostaufbau und Vermeidung von Aspirationen ist weiterhin unbekannt.